温度及pH对胞外乳糖酶酶学性质的影响

秦 操

（河南省新乡市红旗区职业高中，河南 新乡 453003）

乳糖酶被国际酶学委员会命名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，简称为β-半乳糖苷酶，其能催化乳糖水解生成等摩尔量的葡萄糖和半乳糖[1-4]。

牛乳是营养丰富的天然食品，其中乳糖含量约为4.7%～5.0%，是乳中最重要的碳水化合物。对于体内缺乏乳糖酶的人群，乳糖在小肠中不分解而直接进入大肠，被大肠中的细菌酵解产生多种气体及短链脂肪酸，会导致腹胀、排气增多、腹痛和腹泻等不良病症，被称为乳糖不耐症[5]。利用乳糖酶水解乳中的乳糖是解决乳糖不耐症的最佳途径，乳糖酶在低乳糖乳及乳制品中的应用对于乳品加工具有重要意义。

微生物来源乳糖酶的研究日益受到人们的重视，特别是丝状真菌产生的乳糖酶因其适宜的pH、良好的稳定性、细胞外分泌和表达量较高的特点而成为研究的热点[6-8]。目前，黑曲霉、米曲霉、青霉、毛霉等的乳糖酶已经被分离纯化[9-12]。本研究所选用的是由亮色毛霉经固态发酵所获的胞外高温乳糖酶，此酶作用温度较高，反应速度快，可以有效地减少杂菌污染，且提取时不需要破壁处理。为了使此高温乳糖酶能够真正用于工业化生产，本试验对其产生的高温乳糖酶的最适温度、热稳定性、pH等酶学性质进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵原料：麸皮；发酵菌种：亮色毛酶，购自中国兽医药品检察所；其他培养基材料：酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖等；检测试剂盒：ONPG检测试剂盒，购自上海生工生物工程公司。

1.2 试验设备

J-25型高速冷冻离心机、DL201型恒温自动干燥箱、BS-2F 恒温振荡培养箱、磁力搅拌器、JA2003电子天平、DZKW-C型水浴锅、HZQ-F160高压蒸汽灭菌锅、Delta 320 pH计。

1.3 试验方法

1.3.1 乳糖酶固态发酵

将麸皮和蒸馏水按比例1∶1.5混合放入250 mL三角瓶中，装量控制在1/3。其中固体物质定量为10 g，搅拌均匀，作为基础培养基。外加碳源-乳糖为0.05 g·mL-1，外加氮源-蛋白胨0.04 g·mL-1进行高压灭菌，冷却后按15%的接种量制备菌悬液，将已接种的三角瓶放入30℃的恒温培养箱中培养3 d[3]。

1.3.2 粗酶液的制备

按料液比（V/W）1∶8 加入水和发酵过的麸皮，浸提并匀速搅拌30 min。经4层纱布过滤后即得粗酶液，静置取上清液保存备用。

1.3.3 乳糖酶的纯化

采用无机絮凝剂对粗酶液进行絮凝处理，在温度20℃，自然pH 下，加入硫酸铝0.002 g · mL-1，30 min后出现大量沉淀，收集沉淀即为纯化的乳糖酶。

1.3.4 乳糖酶活力测定

取试验液1 mL加入试管中，于30℃水浴中平衡10 min，快速加入ONPG 底物溶液5 mL（已在30℃水浴中达到平衡），混合，精确反应10 min后，迅速加入碳酸钠溶液2 mL，混合，室温下静止；空白管的制备：将添加ONPG底物溶液与碳酸钠溶液的顺序颠倒，其余对样品的处理不变；用分光光度计在420 nm 处测定样品和空白液的吸光度；以1 min 内催化ONPG 水解生成1 μmol 邻硝基酚的酶量为一个酶活力单位[5]。

1.3.5 温度对酶活性的影响

将提纯的酶液在30、40、50、60、70、80℃下与ONPG反应，通过比较相对酶活力的大小，检测温度对酶活性的影响。

1.3.6 温度对酶稳定性的影响

将提纯的酶液在30、40、50、60、70℃各处理120 min 后，立即用冷水冷却，检测酶活力，通过比较相对酶活力的大小，检测温度对酶稳定性的影响。

1.3.7 酶低温保存稳定性

将粗酶液和纯酶液分别在4℃条件下低温保存，每隔10 d测定其酶活力，通过比较相对酶活力的大小，考察酶的低温保存稳定性。

1.3.8 pH对酶活性及稳定性的影响

将提纯的酶液在不同的pH 下与ONPG 反应，测定其酶活力，通过比较相对酶活力的大小，考察pH对酶活性的影响；将提纯的酶液在不同的pH下处理24 h，每隔4 h 测定其酶活力，通过比较相对酶活力的大小，考察pH对酶稳定性的影响。

2 结果与分析

2.1 温度对酶活性的影响

温度对乳糖酶活力的影响见图1。

图1 温度对乳糖酶活力的影响

温度是影响酶活性的较主要因素，通常情况下各种酶都会有一个最适温度，在此温度下酶的活力最高。如果温度太高会影响酶蛋白的次级键，使蛋白质变性，降低其酶活性。由图1可见，亮色毛霉乳糖酶的活性在＜60℃时随温度的升高直线上升，＞60℃之后酶活力开始迅速下降，表明其最适作用温度为60℃，其最适作用温度较高，属于高温乳糖酶，此温度下可有效防止杂菌的污染。在80℃时酶活力很低，只有最适酶活力的21%，主要是由于高温使乳糖酶蛋白分子中的氢键、离子键等非共价键的断裂，破坏了酶蛋白的天然结构从而降低其酶活性。

2.2 酶的温度稳定性

酶的温度稳定性见图2。

图2 酶的温度稳定性

从图2可以看出，在30～50℃时，残留酶活力约为90%，在60℃下处理相同时间其残留酶活力为76.54%，在70℃下处理120 min其残留酶几乎全部失活。对于普通的酶蛋白质来说，温度越低稳定性越好，温度越高热失活越快。所以酶蛋白大部分需要贮存在较低的温度条件下。亮色毛霉发酵所获得的乳糖酶虽然在60℃时的酶活力最高，但是该温度下，乳糖酶的稳定性较差，其酶活力损失较大，不适合应用于需较长反应时间的工业化生产中，因此从稳定性和最大酶活力两方面考虑，在工业生产应用中的作用温度应该选在50℃，而不能采用此乳糖酶最大酶活力时的温度60℃。在50℃附近既能够在一定程度上减少杂菌的污染，同时又可以延长其使用时间，降低生产成本。

2.3 酶的低温保存稳定性

酶的低温保存稳定性见图3。

图3 酶的低温保存稳定性

由图3可见，不管是粗酶液还是纯酶液都具有较高的低温稳定性。但纯酶液在低温保存中的损失率要低于粗酶液。纯乳糖酶蛋白在低温贮存20 d后酶活才开始降低。主要是由于纯酶液在提纯过程中去除了蛋白酶，从而消除了蛋白酶对乳糖酶蛋白的降解作用，从而提高了其稳定性。

2.4 pH对酶活力的影响

pH对酶活力的影响见图4。

图4 pH对乳糖酶酶活力的影响

由图4可见，乳糖酶作用的最适pH为4.5。当pH超过6.0时酶活显著降低（P＜0.05），主要原因可能是由于酸碱的变化影响酶蛋白活性中心氨基酸残基的解离情况所引起的。

2.5 pH对酶稳定性的影响

乳糖酶的pH稳定性见图5。

图5 酶的pH稳定性

不同的pH 也会对酶的稳定性产生影响。通过对酶的pH稳定性进行测定，可以找到能够使酶保持相对稳定的pH 条件，使酶达到最大酶活力限度，从而对酶进行贮藏或生产，由图5可见，pH 稳定性试验表明，该酶的稳定范围在4.0～5.5。

3 讨 论

目前，工业生产中用于分解乳糖的乳糖酶多从酵母、曲霉菌或乳酸菌中经诱导产酶后提取获得，但均不耐热，仅能在常温下工作[13]。因在常温下化学反应速度较慢，所需时间长，容易受到细菌污染而发生变质。此外，为缩短水解时间，所需添加的酶量又较大，因此成本也高。而高温乳糖酶在工业应用中具有突出的优点，如水解温度高、酶反应速度快、酶用量低、反应时间短、省时省力并且能防止杂菌污染等。因此，高温乳糖酶的研究日益引起人们的重视。李宁等对黑曲霉D2-26高温乳糖酶的酶学性质进行了研究，发现其最适温度为70℃，在30～60℃有较高的耐受性；最适pH为2.5，pH稳定范围在2.0～9.0；Mn2+对乳糖酶活性有显著的激活作用（P＜0.05），Hg2+、Pb2+对酶活有较强的抑制作用[14]。蒋燕灵等对从栖热菌中分离得到的耐热乳糖酶的理化性质进行了研究，发现该耐热乳糖酶的等电点约为7.2，不同于其他来源的乳糖酶[15]。史应武等从101株低温菌中发现了1株产高温β-半乳糖苷酶菌株G2005，该酶的最适pH为6.5，最适作用温度为50℃，在30～60℃范围内，具有较好的稳定性；Mg2+增强酶活，而Hg2+、Gu2+、Mn2+抑制酶活[16]。

本试验探讨了温度、pH 对亮色毛霉经固态发酵所获得的高温乳糖酶的活性及稳定性研究，结果表明，该酶的最适温度是60℃，此温度下可有效防止杂菌的生长，降低了生产过程中杂菌污染的风险；在4℃保存中，纯酶液、粗酶液的酶活性均呈现较高的稳定性，但纯酶液的酶活力变化不大，主要是由于在提纯过程中除去了蛋白酶；pH 对酶稳定性范围是4.0～5.5，在最适pH 4.5 的附近，此酸度下，细菌的生长速度受限，进一步提高产品的保存质量为亮色毛霉乳糖酶的生产和储藏条件提供了参考依据。

[1]张红艳,刘成更,赵文娟,等.乳糖酶的酶学特性及其研究进展[J].食品研究与开发,2004,25（6）:34-36.

[2]高秀容,马力,叶华.β-半乳糖苷酶的研究进展[J].生物技术通报,2005（3）:18-20,30.

[3]何梅.乳糖酶缺乏和乳糖不耐受[J].国外医学（卫生学分册）,1999,16（6）:339-342.

[4]史应武,娄恺,常玮,等.一株产高温β-半乳糖苷酶低温菌株及其酶学性质研究[J].食品与发酵工业,2007,33（2）:56-58.

[5]Shaikh S A,Khire J M,Khan M I.Characterization of a thermostable extracellular β-galactosidase from a thermophilic fungus Rhizomucor sp.[J].Biochemica Et Biophysica Acta,1999,1472（1-2）:314-322.

[6]Van Casteren W H M,Eimermann M,Van den Broek L A M,et al.Purification and characterisation of a β-galactosidase from Aspergillus aculeatus with activity towards（modified）exopolysaccharides from Lactococcus lactis subsp.cremoris B39 and B891[J].Carbohydrate Research,2000,329（1）:75-85.

[7]Nakkharat P,Haltrich D.Purification and characterization of an intracellular enzyme with β-glucosidase and β-galactosidase activity from the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus CBS 236.58[J].Journal of Biotechnology,2006,123（3）:304-313.

[8]王立红,刘鼎阔,张俊霞,等.采用固态发酵法对益生菌代谢产物影响因素分析[J].饲料工业,2012（3）:1054-1057.

[9]王艳萍,曹少伟,程巧玲,等.固态发酵乳糖酶浸提液絮凝条件的研究[J].中国食品添剂,2008（4）:15-18.

[10]谭树华,Majid H A A,高向东,等.脆壁克鲁维酵母乳糖酶提取物性质研究[J].药物生物技术,2000,7（3）:153-156.

[11]郝秋娟,李永仙,李崎.淀粉液化芽孢杆菌产β-葡聚糖酶培养基优化以及酶稳定剂的研究[J].中国酿造,2006（4）:18-22.

[12]李红飞.黑曲霉D2-26乳糖酶分离纯化及酶学性质研究[D].保定:河北农业大学,2006.

[13]陈卫,张灏,丁霄霖.一种高温乳糖酶的酶学性质及对牛乳中乳糖的水解[J].中国乳品工业,2002（6）:15-18.

[14]李宁,李红飞,柯晓静,等.黑曲霉D2-26高温乳糖酶的酶学性质研究[J].微生物学通报,2008,35（7）:1045-1050.

[15]蒋燕灵,朱俭,俞一萍.耐热乳糖酶的纯化及理化性质研究[J].中国食品学报,2005,5（1）:43-46.

[16]史应武,娄恺,常玮,等.一株产高温β-半乳糖苷酶低温菌株及其酶学性质研究[J].食品与发酵工业,2007,33（2）:56-58.