6味中草药及配伍方剂提取物对3株大肠杆菌的体外抑菌试验

王莹莹，付小宝，于 聪，李 冰，王雪莹，郝景锋

（吉林农业科技学院动物医学学院，吉林 吉林 132101）

随着在防疫与治疗上对抗生素的依赖性逐渐增大，耐药性、药物残留等问题接踵而至，大肠杆菌又属于多血清型和变异性强的细菌，极易产生耐药性[1-2]。中草药以其抗菌消炎、不易产生耐药性、无毒（低毒）、无残留（低残留）等特点脱颖而出[3]。试验选用6味中草药及其配伍方剂提取物对3株大肠杆菌进行了体外抑菌实验，以期为临床治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株：大肠杆菌1（O111∶K58）、大肠杆菌2（O128∶K67）、大肠杆菌3（O44∶K74），来自吉林农业大学预防兽医学微生物实验室。培养基：普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、ss琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、伊红美兰琼脂培养基、改良马丁肉汤培养基（加微量酚红）。单味药物：板蓝根、黄连、鱼腥草、金银花、蒲公英、大青叶。配伍方剂：方剂一由黄连、鱼腥草、蒲公英组成；方剂二由板蓝根、黄连、鱼腥草、金银花、蒲公英、大青叶组成；方剂三由金银花、板蓝根、鱼腥草、黄连、大青叶组成。

1.2 试验方法

1.2.1 药液制备

每味中草药均按照水提法进行煎煮，加热至沸后改用文火保持30 min，用纱布过滤，重复2 次，合并3次滤液，浓缩至含生药1g·mL-1，1000 rpm离心15 min，取上清液置于试管中备用，按照配伍方剂要求，分别取等量药液，配出3个配伍方剂，置于试管中，调pH 至7.4～7.6，100℃灭菌10 min后，4℃保存备用[4]。

1.2.2 培养基制备

普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、ss琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、伊红美兰琼脂培养基、改良马丁肉汤培养基（加入微量酚红），均按照常规方法配制，调pH至7.2～7.6，高压灭菌，制成平板培养基（除肉汤培养基外），冷却后置于无菌室备用。

1.2.3 菌液制备

从分离菌株试管的斜面上挑取2～3接种环的细菌分别接种于SS 琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、伊红美兰琼脂培养基上，37℃培养12～18 h后，观察大肠杆菌的生长情况，从牛肉膏蛋白胨培养基上挑取乳白色的单个菌落，接种于5 mL 普通营养肉汤中，37℃培养24～36 h，取0.5 mL 于普通琼脂平板上培养8～12 h，用灭菌生理盐水洗下菌落并稀释，后用平皿倾注法估测活菌数后稀释至1.0×109cfu·mL-1，即为试验菌液。

1.2.4 最小抑菌浓度

采用试管二倍稀释法，向灭菌试管中加入改良马丁肉汤培养基1 mL，依次编号，在第1管内加入药液1 mL，混匀后吸取1 mL，至第2管，依次类推至第9管弃去1 mL，然后于每管中加入改良的马丁肉汤培养基0.1 mL作103稀释（约含1.0×105cfu·mL-1）的菌液，第10 管作为阳性对照，第11 管作为阴性对照。第1管至第9管药物浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.8、3.9 mg·mL-1，37℃培养18～24 h，观察结果。以培养物透明、不显红色的药物浓度为该药物的最小抑菌浓度（MIC）。从该试管中取培养物0.01 mL 接种到普通琼脂平板上，37℃培养24～48 h，以菌落数＜3个视为无细菌生长，以无细菌生长的药物最低浓度作为该药的最小杀菌浓度（MBC）。重复试验3次，取平均值。

2 试验结果

6 味中草药及其配伍方剂对3 种血清型大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度见附表。

附表 6味中草药及配伍方剂对3种大肠杆菌的MIC和MBC mg

由附表可以看出，单味黄连和方剂三的MIC值最小，表明黄连和方剂三对所选用的大肠杆菌1（O111∶K58）、大肠杆菌2（O128∶K67）和大肠杆菌3（O44∶K74）抑菌效果较明显。

3 讨 论

3.1 发病原因

大肠杆菌病主要发生于密集化养禽场，各种禽类不分品种性别、日龄均对本菌易感。幼龄禽类发病最多，污秽、拥挤、潮湿、通风不良的环境，过冷过热或温差很大的气候，有毒有害气体（氨气或硫化氢等）长期存在，饲养管理失调，营养不良（特别是维生素的缺乏）以及病原微生物（如支原体及病毒）感染所造成的应激等均可导致本病的发生[5-6]。

3.2 耐药性分析

大肠杆菌病已经成为威胁畜禽业发展的主要细菌性疾病之一。大肠杆菌的血清型较多，具有地域差异性，在防治上多采用抗生素治疗，但由于其极易产生耐药性和药物残留等现象，因此急需另一种治疗方式进行优化，而中草药治疗以其抗菌、消炎、不易产生耐药性的特点脱颖而出。刘丽艳以白头翁、黄连、板兰根、大青叶、甘草等药物为主组成的中草药组方按0.5%～1%比例拌料或加入饮水中，结果表明，在感染的不同时期，用中草药防治大肠杆菌病，预防组保护率在94%，比对照组高14%；治疗组在感染的不同时期用药，其最高保护率有很大差异，平均保护率达90.67%，比对照组高8.67%；对蛋种鸡的预防性试验表明，发病率与病死率均较低，分别为1.8%、11.1%，比对照组低2.7%、13.3%；治疗组最高保护率达90%，比对照组高7%。有效率达100%，比对照组高10%，对三黄肉鸡治愈率达94%，比对照组高8%[7]。潘树桥等针对性地选取对本地区大肠埃希氏菌有抑菌作用的中药组成黄芩散经对人工感染鸡和现地应用，结果表明，用于防治肉用仔猪大肠杆菌病具有良好的效果，总保护率达93.0%[8]。

3.3 药敏试验分析

在特定环境下孵育24 h，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性[9]。李淑梅等选用黄连、黄芩、栀子、石榴皮、大黄5味中草药，采用煎煮法提取有效成分，并对这5味中药提取物在体外对致病性大肠杆菌的抑菌效果进行了测定，试验结果表明，不同中药提取物在不同浓度时对大肠杆菌有不同的抑制作用，黄连、黄芩对试验菌株的抑菌作用最强，而其他3 味药物在高浓度时有效，低浓度时无效；黄连、黄芩、大黄3味药物组合能增加抑菌效果，黄连、黄芩和栀子组合也能加强抑菌效果，而在配方中加入石榴皮的抑菌效果增加不显著（P＜0.05）[10]。刘玉庆等用平板法、管碟稀释法检测大肠杆菌、沙门氏杆菌、芽胞杆菌对23种单味中药、复方清热解毒类中药的敏感性，试验结果表明，黄芩、秦皮、黄连、大黄、连翘、金银花、夏枯草、石榴皮等具有清热解毒、泻火燥湿功用的药物抑菌效果较好，以三黄汤为基础方的清热解毒类复方中草药抑菌作用好，对大肠杆菌的MIC为125～500 mg·mL-1，复方中草药比单味MIC高[11]。

本试验利用二倍稀释法测定各血清型大肠杆菌的最小抑菌浓度，通过在培养基中加入指示剂而鉴定抑菌情况。若培养基不变红色时，说明无细菌生长或仅有少量细菌生长，这样便可以更直观的判断结果。由于每种中草药及各配伍方剂的药性与抑菌作用各不相同，因此对3株大肠杆菌的抑菌程度不同，因此各自的最小抑菌浓度也各有区别。由于黄连对该菌的抑制作用较强，因此黄连的MIC最小，而方剂三的MIC次之。单味中药抑菌作用较好，但方剂也有其优势。方剂不仅可以抑菌，同时还有调理动物机体的作用，从而增强其抵抗力。试验结果表明，单味中草药黄连以及由金银花、板蓝根、鱼腥草、黄连、大青叶组成的方剂三对大肠杆菌具有良好的抑菌作用。

4 结 论

试验结果表明，单味中草药黄连以及由金银花、板蓝根、鱼腥草、黄连、大青叶组成的组方对大肠杆菌具有良好的抑菌作用。

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