两种固定化方法的抑藻剂效果研究

张孝杰，陈学豪，周立红

(1．集美大学水产学院，福建 厦门 361021;2．集美大学鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021;3．农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021)

0 引言

当前，人类活动不当引起的水体富营养化已成为主要的环境问题[1]．在我国，太湖、滇池等水域不断爆发的蓝藻水华，不仅使水体水质下降，严重危害人体健康，且成为制约我国社会经济可持续发展的重要因素．沿岸海域赤潮频发也极大影响了渔业资源的数量和质量．因此，如何有效控制富营养化水体中的藻类爆发，成为环境领域的研究热点和前沿[2]．

在藻类爆发的治理方面，抑藻剂的开发与应用被认为是效果显著和极具潜力的应对措施之一[3]．目前，抑藻剂根据其成分大致可以分为物理性、化学性及生物化学性[4]．由于一般化学抑藻剂对环境可能带来二次污染，而且使用剂量通常较大，而物理方法的工作量太大，使得在实际应用中受到限制[5]，因此利用生物间的化感作用来抑制有害藻类的生长研究受到关注[6]．在处理赤潮藻方面，桉木粉[7]、杉木粉[8]、中药[9]、大蒜[10]、玉米秆[11]、孔石莼[12]以及龙须菜[13]等均被报道具有一定的抑藻效果;在处理蓝藻水华方面，大麦秆[14－15]是最早被发现具有抑藻效果也是目前最为成功的抑藻剂之一．另外，李锋民等[16]报道了芦苇化感物质EMA对铜绿微囊藻具有抑制作用，何池全等[17]也发现石菖蒲对水华藻具有净化作用．其他物质如睡莲[18]、水浮莲[19]、稻杆[20]、青稞[21]、枫杨[22]等均被发现可以抑制蓝藻．

尽管有了众多尝试，但是开发更多高效低毒的抑藻剂仍是藻类控制领域的重要环节．此外，抑藻剂的应用方法对于其实际应用价值也至关重要．众所周知，在一个相对开放的水体中，水流的扩散作用可能使抑藻剂的质量浓度迅速降低，以致无法满足抑藻的需要，或者需要加大用量从而大大增加了处理成本．目前，对于抑藻剂的使用方法主要有浸提液直接泼洒、干品抑藻剂直接投入水体等，这样虽然可以使得抑藻剂直接与藻类接触，在某一区域内达到较高抑藻效果，但是也会因为水流的稀释，造成效果的下降，而加大用量又会对水域微环境造成破坏．因此，针对如何有效使用抑藻剂的问题进行研究，将有助于使抑藻剂顺利投入实际应用．固定化技术是用于食品、制药行业的一种成熟技术，通过将游离细胞或酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性以反复利用[23]．目前常用的固定化载体为PVA和海藻酸钠．本文将借鉴这一技术，将抑藻剂固定于不同的载体上，研究其抑藻效果变化，以探索较好的固定化方法．

1 材料与方法

1.1 试验藻种

赤潮藻为塔玛亚历山大藻 (Alexandrium tamarense DH01株系，缩写为ATDH01)，藻种取自国家海洋局第三海洋研究所．采用f/2培养液[10]，培养条件为:温度(20±1)℃，光照3000 lx，光暗比为12 h∶12 h，早、中、晚搅动藻液3次．

淡水水华藻为铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa，缩写为FACHB-905)，藻种购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库．采用BG11培养基培养[11]，培养条件为:温度(25±1)℃，光照3000 lx，光暗比12 h∶12 h，早、中、晚搅动藻液3次．

1.2 抑藻剂的制备

1)茶叶浸提液制备 称取10 g绿茶叶干品置于100 mL烧杯中，加入50 mL去离子水，煮沸10 min倒出原液，茶渣加水再煮10 min，重复3次．合并3次液汁并用去离子水定容至50 mL备用．

2)绿茶干粉 用粉碎机将绿茶叶磨成粉备用．

3)纯海藻酸钠小球制备 取1g海藻酸钠加入50 mL去离子水浸泡1 h，冷却至室温，以注射器吸取后悬空 (至少50 cm的距离以保证成球质量)滴入2%(体积比)CaC12溶液中，固定1 h后滤出小球以去离子水冲洗3次，静置2 h，得海藻酸钠小球，沥干后称重．

4)绿茶浸提液海藻酸钠小球制备 取2g海藻酸钠加入50 mL去离子水浸泡1h后置于100℃水浴搅拌至溶解为透明胶体，冷却至室温再倒入茶叶浸提液50 mL搅匀．同3)方法制球，得茶汁小球，沥干后称重，折算出单位质量小球含有的绿茶浸提液剂量．再根据每个质量浓度组所需抑藻剂的添加剂量，准备一定量的绿茶浸提液小球．

5)绿茶粉海藻酸钠小球制备 取2g海藻酸钠加入100 mL去离子水浸泡1 h后置于100℃水浴并搅拌至溶解为透明胶体，冷却至室温再倒入10 g绿茶干粉搅匀．同3)方法制球，得抑藻剂绿茶粉小球，同4)方法称重、折算及备用．

6)棉片固定化抑藻剂的制备 将PVA高分子胶棉裁剪成小片 (1 cm×1 cm)，5g绿茶叶同1)方法获得10%的浸提液50 mL．每个质量浓度组用5个小棉片为绿茶浸提液载体，将所需剂量抑藻剂滴于棉片上，待完全吸收浸提液后把棉片添加到50 mL藻液中．

1.3 抑藻实验

取100 mL三角瓶洗净消毒，ATDH01、FACHB-905摇匀测定初始密度后分别往各三角瓶中加入50 mL ATDH01或FACHB-905．按等对数间距设置抑藻剂质量浓度梯度，放入载有设定抑藻剂质量浓度的海藻酸钠小球或棉片．其中海藻酸钠固定化绿茶抑藻剂的梯度为:CK、0、0.32、0.56、1.00、1.80、3.20 g/L;棉片固定化绿茶抑藻剂的梯度为 CK、0、0.16，0.25，0.40，0.63，1.00，1.60 g/L．质量浓度为0的藻液中加入不含绿茶的海藻酸钠小球或棉片，CK为不加任何东西的藻液，试验中海藻酸钠小球和棉片均位于水体下半部分．另将一定质量浓度的绿茶粉放置于50 mL ATDH01藻液中，梯度为:0、0.32、0.56、1.00、1.80、3.20 g/L．每组设3个平行，培养条件同1.1所述．每天摇匀并定时观察藻细胞状态，定时取样计数水中藻细胞密度．其中ATDH01藻细胞滴在浮游生物计数板上于解剖镜下观察，FACHB-905置于血球计数板上于显微镜下观察，抑制率(Ri)计算公式:Ri=(N0－NS)/N0×100%，其中:N0为对照组藻密度 (cells/mL);NS为实验组藻密度 (cells/mL)．实验采用Microsoft Excel 2003进行数据整理与分析．

2 结果

2.1 海藻酸钠固定化绿茶抑藻剂对ATDH01抑制作用

经海藻酸钠固定化绿茶浸提液处理1 h后，ρ(抑藻剂)≥1.00 g/L的各组对ATDH01的抑制率均超过84%，其他组则接近50%;1～5 h，各组抑制率均缓慢增加;至24 h，ρ(抑藻剂)≥1.00 g/L的各组抑制率均大幅度增加至接近100%;此后，波动维持在较高抑制率水平．但是从24 h开始，0.32 g/L组抑制率一直波动在较低水平上，一般不超过50%;0.56 g/L组抑制率则居中．加入纯海藻酸钠小球的组整个实验期间抑制率大多在50%左右 (见图1)．

整个实验期间，0.32 g/L组海藻酸钠固定化绿茶粉对ATDH01的抑制率均处于较低水平，最高仅约23%，大部分时间抑制率处于负值;0.56 g/L组在处理5 h内抑制率为负值，24 h后抑制率波动升高，最高达93%;处理后前5 h内，抑制率随着抑藻剂质量浓度的增加而升高;24 h以后，质量浓度在1.00～3.20 g/L的组间抑制率差异不大，抑制率大多在80%以上，最高可达100%(见图2)．

图3为绿茶粉对ATDH01的抑制作用，随着质量浓度的增加，绿茶粉对ATDH01的抑制率逐渐增加;随着时间的延长，各组的抑制率也在增加，且在48 h时各组对ATDH01的抑制率均达到100%．

2.2 海藻酸钠固定化绿茶抑藻剂对FACHB-905的抑制研究

在相同处理时间里，随着海藻酸钠固定化绿茶浸提液质量浓度的增加，其对铜绿微囊藻FACHB-905的抑制率也增加，但增加幅度不大．处理1 h后，仅最高质量浓度组有约21%的抑制率;最高质量浓度组 (3.20 g/L)从处理3 h开始抑制率多大于50%，并且维持较高的抑制率一直到试验结束 (144 h);1.00、1.80 g/L组的抑制率波动较大，且抑制率大多低于50%;低质量浓度组 (0.32、0.56 g/L)的抑制率一般小于30%．另外，纯海藻酸钠小球抑制率明显低于0.32 g/L组 (见图4)．

海藻酸钠固定化绿茶粉对于FACHB-905的影响与海藻酸钠固定化绿茶浸提液的相类似，1h内抑制率均低于20%，且各组差异不大;此后，一般随着抑藻剂质量浓度的增加抑制率增加;随着处理时间的延长，抑制率波动较大，除了3.20 g/L组外，抑制率一般不随时间延长而增加．总体来看，固定化绿茶粉对FACHB-905的抑制率不高，试验期间平均抑制率最高仅55.09%(出现在3.20 g/L组)，其他组抑制率均低于50%(见图5)．

2.3 PVA固定化绿茶浸提液的抑藻效果

在1 h内，无论空白PVA棉片还是加茶叶浸提液的棉片均不能抑制ATDH01．3 h后各试验组均有较高抑制率，并且抑制率与抑藻剂的质量浓度没有明显相关性，0.63 g/L组抑制率最高 (90.42%)，空白棉片也有78.93%的抑制率．一般来说，抑藻剂的质量浓度增加抑制率也增加，但是二者并非呈直线相关．随着处理时间延长，抑制率呈波动增加的趋势．空白棉片在试验期间一般有大于70%的抑制率 (见图6)．

图1 不同质量浓度海藻酸钠固定化绿茶浸提液对ATDH01的抑制率Fig.1 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by sodium alginate on ATDH01

图2 不同质量浓度海藻酸钠固定化绿茶粉对ATDH01的抑制率Fig.2 The inhibitory rate of different concentrations of green tea powder immobilized by sodium alginate on ATDH01

图3 不同质量浓度绿茶粉对ATDH01的抑制作用Fig.3 The inhibitory rate of different concentrations of green tea powder on ATDH01

PVA固定化绿茶浸提液处理FACHB-905 1 h后各组抑制率在16.23%～45.45%之间，即使空白棉片也有16.23%的抑制率;此后，高质量浓度组 (0.63～1.60 g/L)抑制率随着处理时间的延长而增加，低质量浓度组则在一定范围内波动．大部分试验组在试验期间对铜绿微囊藻FACHB-905的抑制率低于50%，仅有高质量浓度组 (0.63～1.60 g/L)在经过48 h以上的处理后抑制率才超过50%，最高达83.52%(见图7)．

图4 不同质量浓度海藻酸钠固定化绿茶浸提液对FACHB-905的抑制率Fig.4 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by sodium alginate on FACHB-905

图5 不同质量浓度海藻酸钠固定化绿茶粉对FACHB-905的抑制率Fig.5 The inhibitory rate of different concentrations of green tea powder immobilized by sodium alginate on FACHB-905

图6 不同质量浓度PVA固定化绿茶浸提液对ATDH01的抑制率Fig.6 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by PVA cotton on ATDH01

图7 不同质量浓度PVA固定化绿茶浸提液对FACHB-905的抑制率Fig.7 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by PVA cotton on FACHB-905

3 讨论

3.1 不同形式绿茶抑藻剂对ATDHO1的抑制作用比较

试验结果显示，绿茶以粉剂或浸提液的形式被海藻酸钠固定化后对ATDH01均有极强的抑制作用．ρ(抑藻剂)≥1.0 g/L的组在24 h后都能达到抑制率的第一个高峰 (95% ～100%)，此后，抑制率会有小幅波动，并保持高抑制率直到试验结束 (168 h);而0.56 g/L组在24 h以后的抑制率一般都在50%以上，最高可达90%以上;低于0.32 g/L则抑藻作用小．由此可见，以绿茶为抑藻物质经海藻酸钠固定化后，使用时其质量浓度为0.56 g/L即可达到理想的抑藻效果，1.00 g/L则几乎可完全抑制．目前，国内外研究的甲藻抑藻剂的使用方法多数都是通过直接泼洒提取液或放入干品抑藻剂的方式，虽迅速，但在大型水域中的效果却难以持久，本研究则将抑藻剂通过固定缓释的方式进行利用，亦可取得不错的抑藻效果．从单纯海藻酸钠小球具有的较高抑藻率 (50%左右)来看，海藻酸钠固定化绿茶抑藻剂的抑藻机理既有绿茶中抑藻物质的作用，也有海藻酸钠的作用．海藻酸钠本身并无生物毒性，但由其制作成的固定化小球中含有大量淡水，而ATDH01是海洋微藻，海藻酸钠小球的加入将释出其中的淡水使盐度快速下降，可能是其产生抑藻作用的原因．另外，海藻酸钠固定化绿茶浸提液比绿茶粉的抑藻效果更快，一般要快5～24 h，这是因为粉剂中抑藻物质的释放需要经过溶解的过程，而浸提液则不需要，因此后者起效更快．

从固定材料上看，除了在第一小时外，PVA胶棉固定化绿茶浸提液对ATDH01的抑制效果与海藻酸钠固定化绿茶浸提液相近，处理第一小时时前者抑制率明显低于后者;当处理质量浓度相同或相近时这两种固定方法抑制率相近．值得注意的是，除了第一小时外，其他处理时间空白PVA棉片也大多有70%以上的抑制率．相比较而言，加了绿茶浸提液的棉片其抑制率并未有大幅度增加，有些甚至更低．PVA高分子胶棉是一种多孔材料，吸水性和吸附微粒能力极强，它本身所呈现出来的抑藻作用很可能是由其强力的毛细管效应使藻细胞被吸附，与其中添加的绿茶浸提液能更密切地接触，因此具有较好的抑藻功效．实际应用中可以考虑以单纯的PVA高分子胶棉作为去除ATDH01的材料．

3.2 不同形式绿茶抑藻剂对FACHB-905的抑制作用比较

本试验中无论是海藻酸钠固定化绿茶浸提液还是绿茶粉对于FACHB-905的抑制作用均不高，二者差别不大，一般都在50%以下，并且抑制率随着处理时间的延长增加不大．另外，空白海藻酸钠小球对于FACHB-905也没有抑制作用．比较绿茶浸提液以PVA高分子胶棉吸附固定以及以海藻酸钠固定的两种方法来看，前者对FACHB-905的抑制率略高、抑制效果略快．处理1 h后海藻酸钠固定法仅最高质量浓度 (3.20 g/L)有21.33%抑制率，而PVA胶棉吸附法则可达45.45%(1.60 g/L)．并且在整个实验期间吸附法抑藻效果均优于海藻酸钠法．与对ATDH01的抑制情况不同，空白PVA胶棉与海藻酸钠小球对FACHB-905均无抑制作用，这与两种微藻的生态要求不同有关．FACHB-905是淡水藻，海藻酸钠小球不会对水体的物理性质有太大影响，而FACHB-905细胞也明显小于ATDH01，从而导致二者受抑制情况差异．从处理效果看，不同固定化形式的绿茶抑藻剂对于FACHB-905来说见效较慢、抑制质量浓度较高，应用价值有待进一步评估．

3.3 两种固定化方法对绿茶抑藻剂性能的比较

海藻酸钠属于天然高分子凝胶载体，具有对生物无毒、传质性能良好、成形方便且固定化密度高等优点，广泛应用于各行业，在水处理方面的应用尚在尝试．本研究首次将其作为抑藻剂的固定化材料，取其环境友好、有效保持抑藻剂质量浓度的特点，有着值得期待的前景．由于其强度较低、抗微生物分解能力较差、在厌氧条件下易被微生物分解[24]的特点，长时间放置在水环境中可能会影响水质．考虑到海藻酸钠固定化绿茶抑藻剂对ATDH01的抑制一般在数小时到1 d以内即产生明显效果，采用该方法进行绿茶抑藻剂的固定化是可行的，且可以回收海藻酸钠小球重复应用．但是对于水华藻FACHB-905的处理则不宜采用，以免其浸泡过久产生降解而致水中有机物含量增加，反而不利于水质净化．

PVA高分子胶棉目前常被制作成日用品，应用广泛，由于其孔径细小吸水性极佳，作为固定化抑藻剂的材料是十分理想的．同时，其毛细管还可以对水中颗粒物产生吸附作用，从而使藻细胞更接近抑藻剂而受到抑制．这种材料可以按需求制作成任何形状，方便现场使用．从本研究结果看，其在抑制赤潮藻ATDH01方面具有理想的效果，但是其对铜绿微囊藻的抑制作用尚有待进一步研究．

[1]胡洪营，门玉洁，李锋民．植物化感作用抑制藻类生长的研究进展 [J]．生态环境 ，2006，15(1):153-l57．

[2]倪利晓，陈世金，任高翔，等．陆生植物化感作用的抑藻研究进展 [J]．生态环境学报，2011，20(6):1176-1182．

[3]彭海清，谭章荣，高乃云，等．给水处理中藻类的去除 [J]．中国给水排水，2002，18(2):29-31．

[4]李锋民，胡洪营．芦苇抑藻化感物质的分离及其抑制蛋白核小球藻效果研究[J]．环境科学，2004，25(5):89-92．

[5]鲜啟鸣，陈海东，邹惠仙，等．淡水水生植物感作用研究进展[J]．生态学杂志，2005，24(6):664-669．

[6]颜天，周名江，钱培元 ．环境因子对塔玛亚历山大藻生长的综合影响 [J]．海洋学报 ，2002，24(2):114-120．

[7]杨维东，刘玉荣，刘洁生，等．桉木粉对塔玛亚历山大藻的抑制作用及其化学基础研究 [J]．环境科学，2007，8(9):2296-2301．

[8]张信连，杨维东，刘洁生，等．杉木粉对塔玛亚历山大藻生长的影响 [J]．海洋环境科学，2005，24(2):23-25．

[9]ZHOU L H，ZHEN T L，WANG X．Effect of five Chinese traditional medicines on the biological activity of a redtide causing alga—Alexandrium tamarense[J]．Harmful Algae，2007(6):354-360．

[10]ZHOU L H，ZHENG T L，CHEN X H．The inhibitory effects of garlic(Allium sativum)and dally trisulfide on Alexandria tamarense and other harmful algae species[J]．Journal of Applied Phycology，2008:349．

[11]欧阳妤婧，杨维东，刘洁生，等．玉米叶对我国几种典型赤潮藻生长的影响研究 [J]．海洋环境科学，2009，28(4):383-386．

[12]南春容，张海智，董双林．孔石莼水溶性抽提液对3种海洋赤潮藻的生长抑制 [J]．环境科学学报，2004，24(4):702-706

[13]刘婷婷．大型海藻龙须菜对三种海洋赤潮藻的抑制效应研究[D]．广州:暨南大学生命科学技术学院，2006．

[14]WELCHIM，BARRETT P R F，GIBSON M T，et al．Barley straw as an inhibitor of algal growth I:studies in the Chesterfield Canal[J]．Journal of Applied Phycology，1990(2):231-239．

[15]FERRIER M D，BUTLER B R，TERLIZZI D E，et al．The effectsof barley straw(Hordeum vulgare)on the growth of freshwateralgae [J]．Bioresour Technol，2005，96:1788-1795．

[16]李锋民，胡洪营，种云霄，等．芦苇化感物质EMA对铜绿微囊藻生理特性的影响[J]．中国环境科学，2007，27(3):377-381．

[17]何池全，赵魁义．石菖蒲净化富营养化水体的研究[J]．南昌大学学报:理科版，1999，23(1):73-76．

[18]ROSTITANO J，NEWCOMBE G，NICHOLSON B．Ozonation of NOM and tox ins in four treated water[J]．Water Research，2001，35:23-32．

[19]邵林广．水浮莲净化富营养化湖泊试验研究 [J]．环境与开发，2001，16(2):28-29．

[20]向丽，邹华，黄亚元，等．稻秆对铜绿微囊藻抑制作用的研究 [J]．环境工程学报，2011，5(2):279-283．

[21]XIAO X，CHEN Y X．Effects of Tibetan hulless barleyon bloom-forming cyanobacterium(Microcy stisaeruginosa)measured by different physiological and morphologic parameters [J]．Chemosphere，2010，81:1118-1123．

[22]马妍，石福臣，柴民伟，等．几种植物对铜绿微囊藻和莱茵衣藻的影响 [J]．南开大学学报:自然科学版，2010，43(3):81-87．

[23]刘帅，张培玉，曲洋，等．包埋法固定化微生物技术中的载体选择及在污水生物处理中的应用 [J]．河南科学，2009，27(5):554-558．

[24]马成浩，彭奇均，于丽娟．海藻酸钠生产工艺降解情况研究[J]．中国食品添加剂，2004(2):17-19．