花鳗鲡病原菌弗氏柠檬酸杆菌的鉴定

杨方园，关瑞章，2，3，李忠琴，2，3，于海振，李秋云

(1．集美大学水产学院，福建 厦门 361021;2．农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021;3．集美大学鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021)

0 引言

花鳗鲡(Anguilla marmorata)为鳗鲡目(Anguilliformes)鳗鲡科(Anguillidae)鳗鲡属(Anguilla)鱼类，属热带、亚热带江海洄游鱼类，其分布范围广，国内有长江及闽江下游等地;国外北达朝鲜南部及日本纪州，西达东非，东达南太平洋的马贵斯群岛，南达澳大利亚南部[1]．近年来由于自然水体污染严重及过度捕捞，花鳗鲡野生资源量急剧下降，1988年被我国列为国家Ⅱ级野生保护动物．花鳗鲡肉味鲜美，营养丰富，其脂肪和蛋白质含量都很高，有滋补强壮之功效，为食用鱼类中的珍品[2]．目前，国内外关于花鳗鲡病害的研究较少，主要报道了花鳗鲡的基础生物学、人工养殖模式及养殖技术等[3－5]，有关花鳗鲡的细菌性病原的研究未见报道．2012年5月，集美大学水产试验场养殖的花鳗鲡发病，累计死亡率达到20%～25%．病鳗主要症状是鳃部严重肿胀，轻压流出大量白色脓液，解剖后观察鳃丝溃烂，肝脏失血，胆囊肿大，初步显微观察，发现病鱼肝脏寄生大量细菌．因此，本研究拟对该病病原进行分离、鉴定及药物敏感性试验，以期为该病的防治提供参考依据．

1 材料与方法

1.1 材料

1)试验材料 试验用花鳗鲡取自位于厦门的集美大学水产试验场．取症状明显的病鳗用于病原分离与检测;选体色正常、体表无损伤、活力良好、平均体重为(10±2)g的健康花鳗鲡用于人工感染试验．

2)主要试剂 普通琼脂、M－H培养基、胰酪胨大豆肉汤 (TSB)(上海博微生物科技有限公司);BUG Agar(美国BIOLOG公司);药敏纸片 (杭州天和微生物试剂有限公司);DNA抽提试剂盒 (OMEGA BIO－TEK);GYZ－15eV发酵型革兰氏阴性杆菌生化编码鉴定管 (杭州天和微生物试剂有限公司)．

1.2 方法

1)细菌分离 取典型症状的病鳗，酒精棉擦拭鱼体，无菌解剖鳃、肝脏以及肾脏组织，划线接种于普通培养基，30℃培养24 h后，挑取优势菌落重新划线培养，挑取单菌落进一步纯化培养，－80℃低温冰箱保存备用．

2)人工感染试验 取健康花鳗鲡随机分组，每组10尾，水箱规格83 cm×55 cm×53 cm，水深30 cm，养殖试验用水为曝气的自来水，定时投食、充气增氧和排污换水，养殖温度控制在(27±2)℃．将从病鳗肝脏分离的优势菌株AMRB6接种于TSB肉汤中，28℃培养24 h，以涂布平板法测定的菌液浓度为1.0×109CFU/mL，用无菌生理盐水10倍梯度稀释，共设定5个试验组，感染剂量为每尾鱼腹腔注射0.1 mL，同时设生理盐水对照组．注射后从出现典型症状的花鳗鲡肝、肾部位进行细菌重分离并鉴定．试验期间观察并记录各组鳗鲡的发病和死亡情况，试验周期为14 d．根据Reed的方法[6]测定半数致死量．

3)生理生化特征检测 将分离所得菌株划线于普通培养基上，30℃培养24h，检查其生长情况及菌落特征，同时进行革兰氏、芽孢染色．采用GYZ－15eV生化检测试剂盒以及Biolog自动微生物鉴定系统，按照产品使用说明书对菌株进行鉴定．

4)16S rRNA序列测定 将菌株AMRB6接种于TSB肉汤中，30℃振荡培养24 h，使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌DNA作为PCR模板DNA．采用陈翠珍等[7]的方法进行细菌16S rRNA的扩增．PCR扩增后的产物纯化后送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因序列测定．将菌株的16S rRNA序列与GenBank中的已知核酸序列进行比对，收集与该菌株同属的其他菌株16S rRNA序列信息，采用DNA star 5.0和MEGA 5.0进行序列同源性分析和系统发育树构建．

5)药敏试验 取培养物均匀涂布于M－H培养基平板上，贴上药敏纸片 (杭州天和微生物试剂有限公司)，30℃培养24 h后测抑菌圈直径，以抑菌圈直径大小作为敏感与耐药的判定指标[8]．

2 结果

2.1 细菌的形态

AMRB6菌株在30℃培养24 h后，普通琼脂平板上呈现灰白色圆形、中央隆起菌落，边缘整齐，表面湿润、光滑，直径约2 mm，革兰氏染色为阴性、短杆状、两端钝圆、无芽孢，大小多为(0.5～0.9)μm×(1.2～2.0)μm．

2.2 人工感染试验

菌株AMRB6腹腔注射感染花鳗鲡在2 d后开始死亡，而对照组在14 d内均正常 (见表1)．花鳗鲡的发病症状主要表现为体色变浅，下颚磨损出血，鳍条充血，鳃部严重肿胀，鳃粘液增多，肝脏失血，胆囊、肾脏轻微肿大，而对照组无症状出现．取人工感染后濒死花鳗鲡病变组织接种，可回收得到AMRB6菌株，证明其为致病菌，对花鳗鲡的半数致死量为3.2×107CFU/mL．

表1 菌株AMRB6人工感染试验Tab．1 Results of artificial infection test by bacterium AMRB6

2.3 菌株生理生化鉴定

菌株AMRB6有动力、氧化酶阴性、触酶阳性、发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸橼酸盐、ONPG、戊糖、山梨醇，不能利用赖氨酸、鸟氨酸、侧金盏花醇等．其GYZ－15eV系统鉴定结果 (见表2)显示，菌株AMRB6为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，鉴定结果可信度为86.13%．Biolog自动微生物系统鉴定结果显示，AMRB6菌株为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，相似性为98.6%(见表3)．

表2 菌株AMRB6的GYZ－15eV系统鉴定结果Tab.2 Identification of bacterial AMRB6 by GYZ－15eV system

表3 菌株AMRB6的Biolog鉴定结果Tab．3 Results of Biolog identification of AMRB6

2.4 16S rRNA序列分析及系统发育树的构建

对菌株AMRB6进行16S rRNA基因序列的测定，PCR扩增产物电泳结果如图1所示．结果表明，菌株AMRB6的16S rRNA部分基因片段大小为1413 bp．将序列输入GenBank进行Blast比对，并利用DNA Star软件与GenBank中相似序列进行系统学分析，构建系统发育树 (见图2)，结果显示其与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)(DQ010114)的同源性高于99%，二者在系统发育树上聚为一簇．综合菌株AMRB6的生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析结果，可以确定该菌株为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，在GenBank中的登录号是JX524616．

图1 菌株AMRB616 SrRNA PCR产物琼脂糖电泳图Fig.1 Agarose electrophoresis of 16S rRNA PCR products from the AMRB6

图2 菌株AMRB6 16S rRNA序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of the AMRB6

2.5 药敏结果

菌株AMRB6对左氧氟沙星、诺氟沙星、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、头孢曲松等14种药物高度敏感;对奥格门丁、多粘菌素B和头孢他啶中度敏感;对利福平、氨苄西林、青霉素、复方新诺明、头孢呋辛、头孢克罗、哌拉西林等13种药物耐药 (见表4)．

3 讨论

1)Biolog微生物鉴定系统是由美国BIOLOG公司推出的微生物鉴定系统，包括细菌、丝状真菌和酵母在内的2000多种微生物，数据库容量大、鉴定范围宽广、实验自动化及标准化程度高，目前已成为细菌分类鉴定中常用的技术手段之一[9]．杜昕波等[10]利用Biolog系统对13株大肠杆菌、15株巴氏杆菌和7株金黄色葡萄球菌进行鉴定，并与传统的形态学、革兰氏染色、生化测定等鉴定结果进行比对，结果表明Biolog系统具有准确、便捷等优点．本研究运用Biolog系统鉴定菌株AMRB6为弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)，这与常规生理生化鉴定以及构建16S rRNA基因序列系统发育树得到的结果是一致的，从而证实Biolog微生物鉴定系统操作标准化、快速省时、准确，显著优于常规生理生化鉴定方法．

2)弗氏柠檬酸杆菌 (Citrobacter freundii)为肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter Werkman and Gillen)细菌．柠檬酸杆菌在自然界广泛分布，在人类胃肠道正常寄居，为机会致病菌[11]，其中弗氏柠檬酸杆菌在适宜的条件下可引起人体脑膜炎、骨髓炎、腹泻、尿路感染、创面感染和败血症等[12－13];该菌亦可在一定条件下引发食物中毒，造成食源性污染[14－15]．近年来，关于柠檬酸杆菌导致水产动物患病死亡的研究也日益增多，林启存等[16]报道了该菌引起中华鳖的出血性败血症，其主要症状为病鳖全身水肿，反应迟钝，鳃腺发炎充血，肝脏肿大充血，肠黏膜脱落且肠道严重积水，肾脏点状充血;陈翠珍等[17]报道弗氏柠檬酸杆菌是造成中华绒螯蟹病死的重要病原菌之一;沈锦玉等[18]报道了该菌引起红螯螯虾发病;李华等[19]首次报道了弗氏柠檬酸杆菌对河蟹的致病性以及感染后引起的病理变化 ，同时探究了该菌对药物的敏感性及生产中药物治疗效果;Sanz[20]报道在美国由该菌引起的虹鳟感染发病．但目前关于弗氏柠檬酸杆菌对鳗鲡属的危害还未见相关报道．本研究认为，弗氏柠檬酸杆菌是花鳗鲡的致病菌，可导致花鳗鲡鳍条充血，鳃部严重肿胀，鳃粘液增多等症状，人工感染试验证实其对健康花鳗鲡有较强致病性．

3)根据药敏试验结果，分离菌对左氧氟沙星、链霉素、庆大霉素、卡那霉素等14种药物高度敏感，对其他抗生素中度敏感或耐药．据余德文[21]和刘明娟[22]的报道指出，不同菌株对药物敏感性差别较大．因此通过药敏实验，可以有针对性地为以后选择用药提供相应的参考，以便准确有效地利用药物进行治疗．

表4 菌株AMRB6的药物敏感性Tab．4 The antibiotic sensitivity of the bacterium AMRB6

[1]EGE V．A revision of the genus Anguilla Shaw:a systematic，phylogenetic and geographical study [J]．Dana Report，1939，16:251-256．

[2]闵志勇．花鳗鲡和日本鳗鲡肌肉生化成分的比较研究 [J]．集美大学学报:自然科学版，1998，3(3):132-135．

[3]邓伟霞，袁重桂，阮成，等．不同投饵率对花鳗鲡黑仔苗生长的影响 [J]．福建水产，2011，33(2):50-52．

[4]曲焕韬，李鑫渲，王敏懿，等．花鳗鲡工厂化循环水高密度养殖模式初探[J]．渔业现代化，2009，36(4):13-16．

[5]李育培，权衡，盛晓洒．花鳗鲡的生物学特性及人工养殖技术 [J]．渔业致富指南，2008，10(4):50-52．

[6]WARDLAW A C．Practical statistics for experimental biologists[M]．Chichester:John Wiley and Sons，1985．

[7]陈翠珍，房海，葛慕湘，等．锦鲤弗氏柠檬酸杆菌的鉴定 [J]．河北科技师范学院学报，2011，25(4):21-25．

[8]叶应妩，王毓三．全国临床检验操作规程 [M]．2版．南京:东南大学出版社，1997:553-562．

[9]张朝正，郭兰珍，黎明，等．Biolog微生物鉴定系统中接种液的替代[J]．生物技术通讯，2009，20(6):836-838．

[10]杜昕波，赵耘，李伟杰，等．利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究 [J]．中国兽药杂志，2008，42(9):31-33．

[11]王新红，周文华．小儿枸橼酸肠炎流行病学分析 [J]．职业与健康，2005，21(8):1192-1193．

[12]THURMV，GERICKE B．Identification of infant food as a vehicle in a nosocomial outbreak of Citrobacter freundii epidemiological subtyping by allozyme，whole-cell protein and antibiotic resistance [J]．J Appl Bacteriol，1994，76:553-558．

[13]刘旭忠，詹贞芳，宋智盛．弗氏柠檬酸杆菌引起关节炎1例 [J]．中华医院感染学杂志，2007，17(9):1078．

[14]ALLER S C，CHUSID M J．Citrobacter koseri pneumonia and meningitis in an infant[J]．J Infect，2002，45:65-68．

[15]周联，张希圣．一起弗氏柠檬酸杆菌引起的食物中毒 [J]．现代预防医学，2002，29(5):678-680．

[16]林启存，朱丽敏．中华鳖弗氏柠檬酸杆菌败血症病原分离鉴定与药敏试验[J]．水产科学，2008，27(1):42-43．

[17]陈翠珍，张晓君．中华绒螯蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的鉴定 [J]．中国人兽共患病杂志，2006，22(2):136-141．

[18]沈锦玉，顾志敏，潘晓艺，等．红螯螯虾弗氏柠檬酸杆菌病病原的分离与鉴定 [J]．中国水产科学，2005，12(2):197-200．

[19]李华，刑殿楼，白国福，等．弗氏柠檬酸杆菌对河蟹致病性的研究[J]．水生生物学报，2001，2(3):217-223．

[20]SANZ F．Rainbow trout mortalities associated with a mixed infection with Citrobacter freundii and IPN virus[J]．Bulletin of the European Association of Fish pathologists，1991，11:222．

[21]余德文．弗劳地枸缘酸杆菌败血症10例报告 [J]．云南医药，1991，12(4):348-349．

[22]刘明娟．枸缘酸杆菌肠炎26例临床分析[J]．实用儿科临床杂志，1991，6(3):128-129．