不同施灸面积的灸法退热作用与体温调节中枢温度敏感神经元活动的关系

董新民,董泉声,张晓琼,朱漓



不同施灸面积的灸法退热作用与体温调节中枢温度敏感神经元活动的关系

董新民,董泉声,张晓琼,朱漓

(四川省中医药科学院针灸经络研究所,成都 610031)

观察灸法退热的体温中枢效应与穴区施灸面积之间的关系。选用新西兰兔30只,分为A组(静脉注射内毒素造模)、B组(注射内毒素后行40℃灸,施灸圆面直径为10 mm)、C组(注射内毒素后行40℃灸,施灸圆面直径为20 mm)、D组(注射内毒素后行48℃灸,施灸圆面直径为10 mm)、E组(注射内毒素后行48℃灸,施灸圆面直径为20 mm),每组6只。实验在动物肌肉松弛、行人工呼吸条件下进行。穴位取至阳穴,以视前区-下丘脑前部热敏神经元放电为指标,观察5组处理对热敏神经元放电的影响。B组与C组、D组与E组比较,中枢温度敏感神经元的放电变化有明显差异,这种差异是由于施灸面积的改变而引起,经统计学检验,具有显著的正相关关系。穴位施灸面积的大小能够影响疗效。

灸法;热证;施灸面积;多觉型感受器;热敏神经元

灸量,即施灸时灸火在皮肤上(着肤或不着肤)燃烧所产生的刺激强度,与疗效紧密相关。影响灸量的4个因素为灸火、灸距、施灸时间和施灸频度[1-2]。灸火的大小、灸距的长短转化为对皮肤感受器刺激的适宜指标(即可影响皮肤感受器活动的指标)是被灸穴区的皮肤温度和面积,我们称之为施灸温度和施灸面积。施灸温度与退热效应及其中枢机制的研究,笔者已作报道[3]。本实验观察不同施灸面积的灸法退热作用与体温调节中枢温度敏感神经元活动的关系,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物

实验选用由四川省实验动物专委会养殖场(许可证号SCXK-14)供应的健康新西兰兔,月龄为3～6个月,体重为2.6～4.4 kg。

1.2 开颅前的处理及开颅手术

实验前一天,手术野(颅顶、双侧颧弓、颈部)和施灸部位剪毛与脱毛(BaS剂)。实验日肌注庆大霉素4万单位,在无菌和普鲁卡因局麻条件下作颧弓钻孔(固定头颅用)和气管插管手术。将兔转移入屏蔽室,静脉注射三碘季铵酚(12 mg/h)麻痹肌肉,行人工呼吸,通气量按呼气末CO2分压调定(由美国Med Tech international Inc.BMI-331A型脉搏血气/呼气末CO2监护仪监测)。用额部与颧弓顶针法固定头颅。自耳缘静脉滴注糖盐水,补充体液与能量。藉空调机恒定室温(25±1)℃。由自控加热器(仿上海生理所复制)与保温毯稳定体温(约38.5℃)。在无菌和局麻条件下自额至枕部切口,暴露颅骨,按Sawyer图谱[4]要求,采用自制前后向与左右向水平仪确定颅骨水平位。

参考Sawyer图谱,用牙钻开颅3处。①改变脑组织温度的U形灌流管孔,位于A4.4～P0.4、L0.5-1.7,垂直下插外径0.9 mm的不锈钢U形管。②测定POAH区脑内温度的温度传感器孔,位于A2.0、L3.8,孔径1 mm,下插包埋传感器的9号针头。上列2个插入管周围的缝隙敷以琼脂,再用牙科水门汀固定。③微电极探测孔,位于A4～AP0,R0.5-4.5。开孔后在体视显微镜(瑞士Wild Heerbrugg Ltd M8型)下剪除硬脑膜,覆盖以琼脂。

1.3 鉴别温度敏感神经元与微电极尖端定位

由立体定位仪(西安西北光学仪器厂WDT-Ⅱ)定位,藉微电极推进器推进能长时程记录的钨丝微电极[5],作细胞外记录。电极尖端为0.5～1m,阻抗为0.5～1MW。自恒温浴槽由蠕动泵将冷(25℃)、热(41℃)灌流液(水)依次输经U形管以改变脑组织温度,观察神经元放电变化规律,鉴别温度敏感神经元。神经元放电频率随脑温之降、升而减少与增高者为热敏神经元(heat-sensitive neuron,HSN),反之者为冷敏神经元(cold-sensitive neuron,CSN),如无明显变化者则为温度不敏感神经元。实验结束时,用凝固法定点微电极尖端部位。取出全脑,用10%甲醛固定脑组织。置脑于厚片切片机内,摆正兔脑位置,以微电极孔为准作0.5 mm厚切片。先在体视显微镜下检查,取有标定点痕迹脑片,置于扫描仪(美国HP公司ScanJet6300C型)扫描取样。扫描精度为1200 dpi。

1.4 内毒素发热模型

内毒素(Endotoxin,ET)是一种具有较强致热作用的外源性致热原,给家兔静脉注射适量ET,即可在17 min左右出现耳温降低[6],即散热减少,提示体内蓄热开始,其后体现为体温升高。笔者采用细菌ET工作标准品,由中国药品生物制品检定所生产。动物于HSN放电稳定后采集对照(基础)数据,继而每兔静注内毒素25 EU,分组处理并持续观察记录HSN放电2 h。

1.5 取穴、灸法、分组与施灸方案

取至阳穴,该穴位于T7-8棘突之间的凹陷处。穴区剪毛,留残桩约1 mm,穴区用直径10 mm或20 mm的圆孔形粘贴纸规范,施灸面积(S)=(直径/2)2×p,S2/S1=4。

灸法采用聚光灸,光源为聚光灯,均匀光斑大小接近定形的圆形穴区,聚光灸与计算机联机,穴区控温精度为设定值±0.2℃。穴位施灸15 min为1个周期,周期内先按设定值温度连续灸10 min,其后停灸5 min;注射ET后即开始行灸,共施灸4个周期,完成施灸后继续观察记录1 h。施灸方案图见图1。

注:A为静脉注射内毒素造模;B为注射内毒素后行40℃灸,施灸圆面直径为20 mm;C为注射内毒素后行48℃灸,施灸圆面直径为20 mm;x轴为时间(s);y轴为神经元放电脉冲数/s

选用新西兰兔30只,分为A组(静脉注射内毒素造模)、B组(注射内毒素后行40℃灸,施灸圆面直径为10 mm)、C组(注射内毒素后行40℃灸,施灸圆面直径为20 mm)、D组(注射内毒素后行48℃灸,施灸圆面直径为10 mm)、E组(注射内毒素后行48℃灸,施灸圆面直径为20 mm),每组6只,雌雄各半,共30例。经鉴别为HSN的列入实验组,为CSN的仅观察不列入。

1.6 信息采集

神经元放电经微电极放大器(上海生理所MIS-9403型)、前置放大器(上海华山医疗用品厂FJC-1型)、时间-幅度窗口鉴别器(上海生理所TAWD-94型)输入二线示波器(汕头超声电子仪器厂SBR-1型),鉴别器与示波器协同选择拟取神经元的放电脉冲,放电脉冲和POAH区温度信息输入“生理实验系统”(成都仪器厂RM6240C型),由该系统记录,采样频率10 kHz。于实验动物HSN放电稳定后开始采集,5 min前对照期后每兔静脉注射内毒素25 EU,随之给予穴位灸法刺激(B组、C组、D组、E组)或不给予灸法刺激(A组),实验全程连续记录HSN放电130 min以上,一次实验采集数据的存储量为700～800 MB。

1.7 数据处理

1.7.1 原始数据

来源于“生理实验系统”采集的HSN放电脉冲,以每秒的脉冲个数作为放电脉冲频率(Hz)。

1.7.2 频率均数

为便于对HSN在2 h内的放电频率变化趋势进行描述和统计,笔者运用了“采样”的概念,以某一时段的HSN放电频率算术平均数(以下简称“频率均数”)代表这一时段观察值的平均水平,采样时段间隔(即采样周期)相对于整个发热周期[6]必须符合奈奎斯特采样定理。另外,还需避免施灸时可能引入的电子干扰信号,取样时段定在停灸间期的5 min,称作“5 min时段”,每次实验全程按时序共可取9个5 min时段,采样周期为1/4 h。这9个时段是静脉注射ET前的5 min时段作为前对照时段(﹣5～0 min时段),其后灸法刺激的4个施灸期后有4个停灸的5 min时段,完成施灸后仍以此规律,间隔10 min采样1个5 min时段,连续可采样4个5 min时段,采样方式见图1。每个HSN在5 min时段的放电频率均数来源于60个/min×5 min=300个原始数据,每组HSN在每个时段的原始数据是300×6=1800个。

1.7.3 定基比

9个5 min时段的放电频率均数是一组按时间顺序排列的动态数列,用以观察、比较HSN的放电在时序上的变化规律,而同一处理组内每个HSN的同质放电会有很大差别,为了消除这种内部构成差别,提高可比性,笔者引入了标准化的概念[7],以前对照5 min时段的放电频率均数作为基期指标值,计算出每个5 min时段放电频率均数的定基比[8](以下简称“定基比”),作为差异性分析的数据。为便于叙述,我们将前对照时段定义为“1时段”,其后各时段按序排列,分别定义为“2、3……9时段”。

1.7.4 统计学方法

数据量采用“定基比”,定基比是经放电频率﹣5 min时段放电频率均数-标准化-定基比的转换而产生的动态比率,虽然其可比性得到极大提高,但数据的分布已发生改变,故采用非参数统计方法进行对比分析。因为组间比较分析涉及差异分析和变量相关关系分析,具体的统计方法详见相应的结果章节。统计工具采用SPSS15.0统计软件。

2 结果

2.1 观察单位的分布

以立体定位仪的定位数据定义观察单位所在的部位,5组30个HSN的分布范围介于A1.0～2.5、R1.4～1.6H1.500～-2.753,单位为mm。

2.2 A组、B组和D组热敏神经元全时段放电频率均数定基比组间比较

笔者前期研究结果[3]已报道,B组热敏神经元全时段放电频率均数定基比与A组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。D组热敏神经元全时段放电频率均数定基比与A组和B组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。检验结果见表1、图2。

表1 5组5 min时段HSN放电频率均数定基比比较

注:与A组比较1)＜0.01;与B组比较2)＜0.01;与C组比较3)＜0.01

注:↑表示A组静注ET,B组、C组、D组、E组静注ET并作施灸处理;↓表示B组、C组、D组、E组施灸结束

2.3 A组、C组和E组热敏神经元全时段放电频率均数定基比组间比较

数据源见表1。每组6兔6个HSN在同一5 min时段的放电频率按组采样,求出定基比,作为本组在这个时段的样本。基期指标值是本组在前对照5 min时段的6个HSN放电频率均数。如前所述,采用非参数统计方法进行对比分析,由于各组间的定基比无相互影响,需要比较的是两组定基比总体分布的差异性,故采用两独立样本的非参数检验法,即检验法[9]。

结果表明,C组热敏神经元全时段放电频率均数定基比与A组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。E组热敏神经元全时段放电频率均数定基比与A组和C组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。检验结果见表1、图2。检验结果提示,注射ET后行48℃灸且施灸圆面直径为20 mm拮抗ET抑制HSN放电的作用极其显著,而行40℃灸且施灸圆面直径为20 mm的这种作用甚微,这与在同温施灸圆面直径为10 mm的结果一致[3]。穴位施灸温度不同,与不同类别皮肤感受器的被兴奋与否有密切的关系,而48℃灸(无其他药物介入)仅能兴奋多觉型感受器(polymodal receptor,PR)[10-12],本文从体温调节中枢的HSN水平表明灸法有效退热的穴位物质基础主要是PR。

2.4 B组和C组热敏神经元分时段放电频率均数定基比组间比较

由图2可见,B组和C组在4～9时段之间的定基比有较大差异,这种差异是否与施灸面积相关?笔者取两组在4～9时段的定基比与各组的施灸面积,进行相关关系分析。数据源见表1。如前所述,采用非参数统计方法,由于笔者采样的定基比是有序等间隔数据,且不满足正态分布,故采用非参数相关分析的等级相关系数[9]进行统计。检验结果表明,相关系数为0.029,＜0.05,即B组和C组在4～9时段放电频率变化的差异与施灸面积的大小存在显著的正相关关系。

2.5 D组和E组热敏神经元分时段放电频率均数定基比组间比较

由图2可见,D组和E组在1～5时段之间的定基比有较大的差异,这种差异是否也与施灸面积相关?笔者取两组在1～5时段的定基比与各组的施灸面积,进行相关关系分析。数据源见表1。统计方法同上。检验结果表明,相关系数为0.025,＜0.05,即D组和E组在1～5时段放电频率变化的差异与施灸面积的大小存在显著的正相关关系。

3 讨论

笔者已经报道直径为10 mm的施灸圆面在施灸温度是40℃与48℃时对ET化兔体温中枢热敏神经元活动的影响[3],本文将同一穴区的施灸圆面直径扩大为20 mm,后者的面积是前者的4倍。C组与B组、E组与D组拮抗ET抑制体温中枢热敏神经元放电的效应比较,总体均未发生有统计学意义的改变,这说明对同一病症,在保证一定施灸面积的基础上,灸法要取得较好疗效的关键是施灸温度的控制[10],即PR的被兴奋[11-12]。

B组和C组在4～9时段HSN放电频率变化有一定的差异,即C组在4～9时段有部分拮抗ET抑制体温中枢热敏神经元放电的效应,这种效应与施灸面积有显著的正相关关系,但C组效应的总体变化与B组比较,差异无统计学意义(＞0.05)。D组和E组在1～5时段HSN放电频率变化有一定的差异,这种差异的发生同样与施灸面积有显著的正相关关系。由图2可见,D组的定基比在1～4时段呈下滑趋势,这是ET作用使然,其后PR被兴奋的作用才得以体现,HSN放电频率才逐渐恢复到正常水平,这是行48℃灸的作用体现,而E组的定基比始终保持在正常水平,PR被兴奋的作用始终体现为HSN放电频率的稳定,ET作用没有得到表现的机会。综上所述,扩大施灸面积且灸温较低的刺激效应体现在时间上偏后且作用较差,而扩大施灸面积且灸温较高的刺激效应在施灸的早期阶段就可以突现。总之,适当提高施灸面积,可以部分提高或完善灸法的疗效。

《小品方》:“灸不三分,是谓徒冤。”即艾炷的直径不到3分(按现行制式换算,3分=10 mm)大小,可谓白受灸灼之苦,可见古人在较早的时期就已经意识到施灸面积的操控对疗效的重要性。按Meeh算式[13]推算,体重60 kg人的体表面积约S人=1.89 m2,体重3 kg兔的体表面积约S兔=0.26 m2,S人/S兔≈7.3,人体要达到相当于兔圆面直径10 mm的施灸面积,需是圆面直径10 mm的7倍(未经科学验证,演算仅供参考)。显然,增加相关施灸穴点是提高施灸面积的可行方法,如果不断缩小施灸面积,或者减少施灸穴点,前述面积与效应的关系,可能会发生有统计学意义的改变,因为施灸面积的大小涉及到能被刺激的PR的多少。施灸温度与施灸面积是灸法的技术核心,当然,根据年龄、病情、体质等诸因素,还需要调整有效的施灸时间,选配适宜的穴位,更需要不断地研究和探索。

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Relationship between the Antipyretic Effects of Moxibustion with Different Active Areas and the Activities of Temperature-sensitive Neurons in Thermoregulator Centers

-,-,-,.

,610031,

To investigate a relationship between the reaction of thermoregulator centers to antipyretic moxibustion and its active area at the point.Thirty New Zealand rabbits were enrolled and allocated to groups A (intravenous injection of endotoxin for model making), B (intravenous injection of endotoxin followed by 40ºC moxibustion with an active area of 10 mm in diameter), C (intravenous injection of endotoxin followed by 40ºC moxibustion with an active area of 20 mm in diameter), D (intravenous injection of endotoxin followed by 48ºC moxibustion with an active area of 10 mm in diameter) and E (intravenous injection of endotoxin followed by 48ºC moxibustion with an active area of 20 mm in diameter). The experiment was performed under the relaxation of animal muscles and artificial respiration. Point Zhiyang was selected. Discharge of temperature-sensitive neurons in the preoptic-anterior hypothalamus was used as an index. The effect of treatment on discharge of temperature-sensitive neurons was observed in the five groups.Comparisons between groups B and C and between groups D and E showed significant differences in discharge of central temperature-sensitive neurons. The differences were caused by the change in the active area of moxibustion. Statistical analysis showed a significant positive correlation.The size of the active area of moxibustion at the point can influence the therapeutic effect.

Moxibustion; Heat syndrome; Active area of moxibustion; Polymodal receptor; Temperature-sensitive neurons

1005-0957(2013)07-0600-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.07.600

2012-12-25

四川省应用基础研究计划资助项目(05JY029-043)

董新民(1951 - ),男,研究员