环维黄杨星D新衍生物对酒精诱导PC12细胞损伤的保护作用

石贞玉，厉永强

（1.河南大学 神经生物学研究所，河南 开封 475004；2.河南大学 护理学院，河南 开封 475004）

环维黄杨星D（Cyclovirobuxine D，CVB－D）系从黄杨科植物小叶黄杨（Buxus microphylla Sieb.et Zucc.Var.Sinica Rehd.et Wils）及其同属植物中提取的一种生物碱，称黄杨宁，亦称环常绿黄杨碱D、黄杨碱等，属孕甾烷衍生物［1］。目前认为环维黄杨星D通过抑制脂质过氧化、清除自由基等对神经元具有保护作用。已有研究［2］发现，环维黄杨星D 对急性缺血、缺氧时的损害性病变有改善和保护作用，同时，环维黄杨星D 有促进脑缺血损伤区神经功能的修复作用，对神经元具有保护作用。

PC12细胞是鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞株，分化的PC12细胞在形态和功能上具有典型的神经内分泌细胞的特征［3］。儿茶酚胺类物质在生物体内具有较强的生理学效应，在脑和神经信号传导中起着重要的作用，同时这类物质具有抗氧化、抗诱变和抗衰老等作用［4－5］。为此，我们的课题通过对环维黄杨星D 进行结构改造，以协同或增效为目的引入具有神经保护作用的儿茶酚胺类基团，合成环维黄杨星D 儿茶酚新衍生物（HD－X）。实验采用酒精诱导PC12细胞损伤模型初步发现，HD－X 对酒精诱导的PC12细胞损伤有较好的保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

大鼠嗜铬神经瘤细胞PC12（中国医学科学院基础医学研究所），生长在含100mL／L胎牛血清（四季青公司产品）的DMEM 培养基（Gibco公司产品）中，放置在含体积分数为5% CO2、37℃培养箱培养；HD－X 由河南大学药物研究所提供，纯度＞99%；二甲基亚砜（DMSO，Solarbi公司生产），贮存浓度为1×10－2mol／L；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Promega公司）；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（上海科兴生物科技有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与实验分组 大鼠嗜铬神经瘤细胞PC12培养于含体积分数为10% 灭活胎牛血清、青霉素（100IU／mL）和链霉素（100 mg／L）的DMEM 培养液培养体系中。培养环境为37℃，含体积分数为5%CO2。取对数生长期的细胞进行实验，实验共分4组：①正常对照组：不加任何处理。②酒精损伤组：2×10－1moL／L 酒精。③酒精损伤＋HD－X 1 组：1×10－5moL／L的HD－X预处理30min，再 加2×10－1moL／L酒精。④酒精损伤＋HD－X2组：1×10－4moL／L的 HD－X预处理30 min，再加2×10－1moL／L酒精。继续培养24h。

1.2.2 MTT 试验 细胞以1×104／L接种到96孔细胞培养板，0.2mL／孔，继续培养24h后换液，分组与处理方法同“1.2.1”。MTT 实验按照文献［5］的方法进行。

1.2.3 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态变化对数生长期细胞按1×104个／mL 浓度接种于提前用多聚赖氨酸处理的盖片上，制作细胞玻片。分组与处理方法同“1.2.1”，继续培养24h后，倾去培养液，加入预冷PBS洗涤细胞2次；调整Hoechst 33258染液浓度至终浓度5 mg／L，37℃避光染色10min；弃去染液，加入体积分数为4% 多聚甲醛4℃固定5min。在荧光显微镜下观察拍摄。激发波长在350nm 左右，发射波长在460nm 左右。

1.2.4 LDH 活性测定 酒精损伤发生后24h收集培养液，用722型分光光度计在340nm 波长下测定LDH的活性。LDH 释放抑制率＝（LDH酒精组－LDHHD－X）／（LDH酒精组－LDH对照组）×100%。

2 结果

2.1 对细胞存活率的影响

在有HD－X 保护的实验组中，PC12细胞对MTT的摄取能力高于模型组（P＜0.05 或P＜0.01），细胞存活率升高，表明HD－X 对酒精诱导的PC12细胞损伤模型具有保护作用。见表1。

表1 HD－X对酒精诱导PC12细胞损伤存活率的影响（）

2.2 形态学观察

酒精作用PC12细胞组中，Hoechst 33258 染色观察细胞凋亡形态学变化，表现为染色质凝集，细胞核碎裂成碎片等典型细胞凋亡特征性变化，在有HD－X保护的实验组中，可见凋亡细胞的数量明显下降。见图1。

2.3 对LDH 释放的影响

PC12细胞在酒精损伤后释放至培养液中的LDH 增多，与正常对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；而加入含HD－X的2个剂量组中发现培养液中LDH 含量的降低（P＜0.05或P＜0.01），漏出减少，表示HD－X 对酒精诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用。见表2。

图3 HD－X对酒精诱导PC12细胞损伤的保护作用形态学观察

表2 HD－X对酒精诱导PC12细胞损伤后细胞LDH 释放的影响（）

3 讨论

研究［6－8］表明，酒精可能通过增加自由基的产生，影响神经递质受体的功能，诱发神经元凋亡，干扰神经营养因子信号通路，激活内源性的细胞凋亡信号途径等分子机制，促进神经细胞的损伤，与阿尔茨海默氏病及其他神经系统疾病有密切联系。PC12细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，与原代培养的神经细胞模型相比，具有神经内分泌细胞的一般特征，是国际上基本公认在体外进行神经生物、神经化学及神经系统疾病研究理想的模型，用于研究多种神经系统疾病，如阿尔茨海默病，帕金森病等，广泛用作研究神经细胞分化、离子通道、受体和递质释放的实验材料，也是研究神经毒性的最主要的细胞株之一［9］。

实验结果表明，酒精对PC12细胞具有明显的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。而预先给予HD－X 后，酒精对PC12 细胞的增殖抑制作用减轻，细胞凋亡率下降。LDH 是细胞质膜标记酶，反映细胞死亡常用的生化指标。培养液中LDH 漏出率在酒精组中明显高于对照组，而预先给予HD－X 后，细胞上清液中的LDH 含量明显减少，提示HD－X 可减轻酒精所致的神经元损伤，对神经元具有一定的保护作用。

综上所述，HD－X 对酒精诱导PC12细胞损伤具有显著的保护作用，关于其保护作用的分子机制还需要今后不断的深入研究和探讨。

［1］瞿凌晨，邢精红，许立，等.环维黄杨星D 对大鼠心肌缺血－再灌注损伤的保护作用初探［J］.辽宁中医药大学学报，2012，14（1）：67－68.

［2］谭峰，顾卫，万赛英，等.环维黄杨星D 对高血压大鼠脑缺血神经胶质原纤维酸性蛋白与神经粘蛋白表达的影响［J］.中华神经医学杂志，2007，6（4）：349－353.

［3］Westerink R H，Ewing A G.The PC12cell as model for neurosecretion［J］.Acta Physiol（Oxf），2008，192（2）：273－285.

［4］Garcia C R，Angele－Martinez C，Wilkes J A，et al.Prevention of iron－and copper－mediated DNA damage by catecholamine and amino acid neurotransmitters，L－DOPA，and curcumin：metal binding as a general antioxidant mechanism［J］.Dalton Trans，2012，41（21）：6458－6467.

［5］Shimizu T，Nakanishi Y，Nakahara M，et al.Structure Effect on Antioxidant Activity of Catecholamines toward Singlet Oxygen and Other Reactive Oxygen Species in vitro［J］.J Clin Biochem Nutr，2010，47（3）：181－190.

［6］Wu D，Cederbaum A I.Alcohol，oxidative stress，and free radical damage［J］.Alcohol Res Health，2003，27（4）：277－284.

［7］Rump T J，Abdul M P M，Szlachetka A M，et al.Acetyl－L－carnitine protects neuronal function from alcohol－induced oxidative damage in the brain［J］.Free Radic Biol Med，2010，49（10）：1494－1504.

［8］胡艳秋，蒋杞英，程相树，等.乙醇对发育期小鼠海马神经元数量的影响［J］.河南大学学报：医学版，2007，26（3）：20－22.

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