HPLC法测定玉美人轻身减肥片中大黄素和大黄酚的含量

李武营，胡海廷，王翠红

（1.河南大学 学报编辑部，河南 开封 475000；2.河南大学 药学院，河南 开封 475004）

玉美人轻身减肥片由大黄、防己、丹参等11味中药组成，具有轻身减肥、益气健脾、活血化瘀、宽胸去积的功效。此方收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十九册。大黄为该制剂的君药，含有大黄素（Emodin）和大黄酚（Chrysophanol）等有效成分［1］。标准中尚无含量测定项目。该药中有效成分的测定文献［2－5］报道较少。我们以大黄的主要有效成分大黄素和大黄酚为指标，采用高效液相色谱法测定其在轻身减肥片中的含量，结果获得满意的效果。该方法操作快捷、简便、准确可靠、专属性强，方法可行。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（包括G1311C四元泵，G1329B 自动进样系统，G1316A 柱温箱，G1314FVWD 检测器，Agilent ChemStation 色谱工作站）；色谱柱Hypersil－ODS（4.6mm×150mm，5μm）；AG135型电子天平（瑞士，梅特勒－托利多）；HS10260D型超声波清洗机（天津市恒奥科技发展有限公司）等。

1.2 试剂

玉美人轻身减肥片（陕西华龙制药有限公司，生产批号：20110401，20110601，20110701，规格：0.28g／素片）；大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110756－200110）；大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110796－200716）；甲醇（高效液相色谱专用，一级色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司）；纯净水（乐百氏有限公司）；醋酸（天津市德恩化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品储备液的制备

精密称取大黄素、大黄酚对照品5.00 mg 于100mL容量瓶中，加流动相适量使溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀即得50.0μg／mL的对照品储备液。

2.2 标准溶液的制备

精密量取大黄素储备液1.00mL于10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得5.00μg／mL的大黄素标准溶液。

精密量取大黄酚储备液2.00mL于10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得10.0μg／mL的大黄酚标准溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品20片，除去糖衣，精密称定，精密称取2片重，置100mL容量瓶中，加流动相适量，超声提取1h 使之完全溶解，冷却至室温，用流动相稀释至刻度，静置，取上清液，用0.22μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 实验条件的选择［6－7］

色谱条件：Hypersil－ODS 柱（4.6 mm ×150mm，5μm）购自大连依利特公司；流动相：甲醇－0.1%醋酸（85∶15 ）；柱温：室温；流速：1.0 mL／min；检测波长：254nm；进样体积：20μL。在此色谱条件下，得到大黄素、大黄酚对照品溶液的HPLC 图谱（图1）及供试品溶液的HPLC图谱（图2）。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系 取“2.2”项下的5.00μg／mL的大黄素标准溶液和10.0μg／mL的大黄酚标准溶液，在“2.4”项色谱条件下，分别进样5、10、15、20、25μL记录色谱峰面积，以相应峰面积（A）为纵坐标，进样量（μg）为横坐标。结果见表1、表2。

以峰面积Y 对进样质量X 进行线性回归，得回归方程为：

大黄素：Y＝3248 X＋0.4，r＝1.0000，n＝5。

大黄酚：Y＝4994.4 X－3.1，r＝1.0000，n＝5。

实验结果表明，大黄素、大黄酚分别在0.025～0.125μg，0.05～0.25μg范围内，呈良好的线性关系。

图1 大黄素和大黄酚对照品溶液的HPLC图谱

图2 轻身减肥片供试品溶液的HPLC图谱

表1 标准曲线（大黄素）

表2 标准曲线（大黄酚）

2.5.2 精密度实验 取“2.2”项下5.00μg／mL的大黄素标准溶液和10.0μg／mL的大黄酚标准溶液，在“2.4”项色谱条件下，进样15μL各重复9次，分别测定其峰面积，大黄素RSD为0.51%，大黄酚RSD为0.26%。

2.5.3 重现性实验 取同一批样品按“2.3”项下方法配制样品溶液6 份，每份溶液进样20μL，记录色谱图，以外标法计算，得大黄素含量的重复性RSD为0.98%，大黄酚含量的重复性RSD为0.37%。

2.5.4 稳定性实验 取“2.3”项下供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下，分别在样品制备后0、2、4、8、12h各进样1次，连续考察12h，每次进样20μL，记录色谱图，测定峰面积。结果表明，供试品溶液在12h内稳定。

2.5.5 回收率实验 精密称取已知含量的样品1片重9份，再分别加入一定量的大黄素、大黄酚对照品储备液，按“2.3”项供试品溶液制备方法及“2.4”项色谱条件下，以外标法进行测定，计算回收率。结果显示，准确度较好。见表3、表4。

2.5.6 含量测定 取3批轻身减肥片，按“2.3”项下的方法制备3份供试品溶液，分别用0.22μm 滤膜滤过，取续滤液，按“2.4”项下色谱条件测定，由外标法计算，结果见表5。

表3 大黄素的回收率实验（n＝9）

表4 大黄酚的回收率实验（n＝9）

表5 样品含量测定（n＝3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

比较了不同比例的甲醇－水系统、甲醇－醋酸系统以及甲醇－0.1%磷酸系统为流动相，结果表明，用甲醇－0.1%醋酸（85∶15）作为流动相测定轻身减肥片中大黄素和大黄酚的含量较为适宜，分离效果较好，峰形尖锐，保留时间适宜，且其他成分对此无干扰，故用此为流动相。

3.2 提取方法的考察

本实验对不同溶剂、不同溶剂体积和不同提取时间进行考察，经实验比较，结果表明，每片样品加50mL甲醇－0.1%醋酸（85∶15），超声60min能够提取完全。实验定其为样品处理方法。

［1］国家药典委员会编.卫生部药品标准中药成方制剂第十九册［S］.北京：中国医学科技出版社，1998：135.

［2］韩紫岩，郭新社.大黄复方制剂对局灶性脑缺血模型大鼠的影响［J］.河南大学学报：医学版，2010，29（1）：45－48.

［3］陈志桃，季火英.高效液相色谱法测定轻身减肥片中大黄素大黄酚的含量［J］.海峡药学，2004，16（3）：49－51.

［4］张云，宋旭峰.高效液相色谱法测定轻身减肥片中大黄素与大黄酚的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2002，8（5）：4－6.

［5］杨春静.轻身减肥片中淫羊藿苷含量的高效液相色谱法测定［J］.中医学报，2011，26（1）：64－66.

［6］国家药典委员会编.中华人民共和国药典·1 部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：22.

［7］杨振涛，陈霞，李黎明，等.正交实验法提取网果酸模中大黄素和大黄酚的工艺研究［J］.西北药学杂志，2011，26（1）：24－25.