裂解血球全血与健康动物血清在牛多杀性巴士杆菌病灭活疫苗生产中使用效果对比试验

何玉仙，黄炯，张读朴，陈宏，余洪磊

（1.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐830032；2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐830000）

裂解血球全血与健康动物血清在牛多杀性巴士杆菌病灭活疫苗生产中使用效果对比试验

何玉仙1，黄炯2，张读朴1，陈宏1，余洪磊1

（1.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐830032；2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐830000）

兽用生物制品制造及检验规程中规定：牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗在通气培养过程中，需添加0.1%裂解血球全血。本试验通过在合成培养基中添加裂解血球全血与健康动物血清培养对比，发现在牛多杀性巴士杆菌病灭活疫苗生产中添加一定量健康动物血清，其生长菌数、效力检验、安全检验均与添加0.1%裂解血球全血生产检验指标相一致，且有降低污染率、降低生产成本的效果，值得生产中推广使用。

裂解血球全血；健康动物血清；安全检验；效力检验；生产成本

兽用生物制品制造及检验规程中规定牛多杀性巴士杆菌病灭活苗生产培养基中需添加0.1%的裂解血球全血进行通气培养[1]。本试验目前所采用的方法是：采羊颈部动脉全血做裂解血球。在采集羊血中不仅需要确保操作人员及环境的洁净，而且还要确保羊只健康，血液中不带病菌及病毒，才能保证培养基中添加裂解血球全血培养出的菌液质量合格。这使得生产和采购人员的劳动强度增大，同时污染几率也变大，而目前市场上可以买到大量健康无菌的犊牛血清，添加健康犊牛血清造成菌液污染的几率较羊血减小。本试验用不同含量的羊裂解血球全血与健康犊牛血清比较通气培养的效果，尝试用健康犊牛血清代替羊裂解血球全血进行生产[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 裂解血球全血

本试验所用绵羊购自新疆米泉市，无菌方式采集绵羊鲜血，加入已灭菌的抗凝剂瓶中，经-15℃冻融两次而得。

抗凝剂配制：柠檬酸0.65 g;柠檬酸钠16 g;葡萄糖41 g;氯化钠8.4 g，加入蒸馏水1 L配制而得，每10 L血清瓶中装600 mL抗凝剂，用于采一只羊的血量。

1.1.2 健康犊牛血清

兰州民海生物或内蒙金源康生物制品厂提供，500 mL/瓶。

1.1.3 消泡剂

金龙鱼或其他品牌食用调和油适量。

1.1.4 主要器材和设备

1 mL吸管，10 mL吸管，吸耳球，平皿，15＃试管，恒温培养箱（由中国南京恒裕电子仪器厂制造，型号HP-300A）。

1.1.5 试验动物

家兔、小白鼠均为本公司品管部动物房提供。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 生产种子制备

（1）一级种子繁殖及鉴定将各株冻干菌种分别接种于含0.1%裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24 h，然后按其培养特性的标准要求，每株挑选5个以上典型菌落，分别接种于鲜血琼脂斜面若干支，37℃培养24 h，作为一级种子。在2℃～8℃保存。

（2）二级种子繁殖将各株一级种子分别接种于含0.1%裂解血球全血的马丁肉汤中，37℃培养24 h后，分别取样用马丁琼脂做纯粹检验；置2℃～8℃保存。

1.2.1.2 制苗用培养基

使用的是车间自制复合培养基，其主要成分为氯化钠、酵母浸出粉、蔗糖和酪蛋白胨[3]。

1.2.1.3 制苗用菌液制备

（1）菌液培养将各级二级种子菌液等量混合，按培养基总量的1%～2%接种二级种子液，并分别按0.15%、0.10%、0.05%含量添加绵羊裂解血球全血及适量消泡剂，按0.4%、0.2%、0.13%的比例添加健康犊牛血清及适量消泡剂，以逐渐增加通气量的方法，在37℃培养16～18 h。

（2）培养生长均在本公司生产车间负压灭活菌苗生产线反应间的3个反应罐中进行，各反应罐培养基量均为1 300 L，3个反应罐通气量大小、反应时间和消泡剂使用量均相同。

（3）培养生长分三次进行，第一次为添加不同含量的裂解血球全血3个反应罐37℃培养；第二次为添加不同含量的健康犊牛血清3个反应罐37℃培养；第三次为添加一罐为0.05%绵羊裂解血球全血，两罐为0.13%健康犊牛血清37℃培养。

（4）纯粹检验及活菌计数菌液培养完成后，每罐分别取样，用马丁琼脂作纯粹检验；并用含0.1%裂解血球全血及4%健康动物血清的改良马丁琼脂平板作活菌计数，作为配苗参考。

1.2.2 灭活、配苗、半成品检验、分装

均按兽用生物制品制造及检验规程中规定制造[1]。

1.3 效力检验[1]

用体重1.5～2.0 kg家兔4只，各皮下或肌肉注射疫苗1 mL，14～21 d后连同条件相同的对照兔2只，各皮下或肌肉注射致死量的C45～2强毒菌液，观察8 d，对照兔应全部死亡，免疫兔至少保护2只。

1.4 安全检验[1]

用体重1.5～2.0 kg家兔2只，分别皮下注射疫苗5 mL；同时用体重18～22 g小白鼠5只，分别皮下注射疫苗0.3 mL，观察10 d，应全部健活。

2 试验结果

2.1 不同含量裂解血球全血及健康动物血清培养效果对比（见表1、表2、表3）

表1 添加不同含量裂解血球全血培养效果对比

表2 添加不同含量健康动物血清培养效果对比

表3 添加不同含量裂解血球全血及健康动物血清培养效果对比

2.2 添加不同含量裂解血球全血与健康动物血清直接生产成本对比（见表4）

表4 添加不同裂解血球全血与健康犊牛血清直接生产成本对比

3 讨论

合成培养基中添加羊裂解血球全血含量在0.05%～0.15%之间，在通气培养条件不变的情况下，细菌生长数量、效力检验、安全检验差别不明显，均符合兽用生物制品制造规程规定。

合成培养基中添加健康犊牛血清含量在0.13%～0.4%之间，在通气培养条件不变的情况下，细菌生长数量、效力检验、安全检验差别不明显，均符合兽用生物制品制造规程规定。

在合成培养基中添加不同含量的羊裂解血球全血与健康犊牛血清，在通气培养条件不变的情况下，其细菌生长数量差别不明显，其效力检验均在2/4～3/4之间，安全检验无论是家兔还是小白鼠均健活，符合兽用生物制品制造规程规定，此试验表明实际生产中无论在培养基中使用羊裂解血球全血，还是使用健康犊牛血清均不影响产品质量，可达到相同免疫效果。

添加含量在0.05%与0.13%、0.1%与0.2%、0.15%与0.4%的羊裂解血球全血与健康犊牛血清在单位生产成本上差别不明显，属于生产可接受范围。目前本公司采购的健康犊牛血清生产厂家全部除菌过滤，保证了犊牛血清质量，营养成分好，无污染，因使用方便，无人工采血的成本，避免了采集羊血过程中可能造成的污染，降低了人工劳动强度，生产上值得推广。

[1]中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000版[M].北京：化学工业出版社:25-26.

[2]陈天寿.微生物培养基制造与应用[M].北京:中国农业出版社，1995.

[3]张读朴，孟建国，黄炯，等.一种经改良的培养基替代马丁肉汤培养基生产牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的试验[C].中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会论文集，北京:中国畜牧兽医学会生物制品学分会,2007,642-643.

Compare the Effect of Whole Blood with Lysed Blood Cells and Healthy Animal Serum on the Production of Cattle Pasteurellamultocid Vaccine

HE Yu-xian1，HUANG Jiong2，ZHANG Du-pu1，CHEN Hong1，YU Hong-lei1
（1.Xinjiang Tiankang Animal Husbandry Biotechnology Limited Liability Company，Urumqi 830032,China; 2.Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000，China）

Veterinary Biologics products industry and inspection procedures provided that:0.1%whole blood with lysed blood cells was needed to add in aerobic culture of bovine pasteurellamultocida inactivated vaccinen.This test compare synthetic medium which was added whole blood with the medium with healthy animal serum-free culture,we found that there are consistent results in the production of cattle Pasteurellamultocid vaccine by adding a certain amount of healthy animal serum in cattle or 0.1%cleavage blood cell.And this method could lower pollution rate,reduce production costs,so it’s worth to use widely.

cracking of blood cells in whole blood;healthy animal serum;safety inspection;potency test;cost of production

S852.5

A

1003－6377（2013）03－0044-04

2013-02-18

何玉仙（1967-），女，兽医师，一直从事兽用疫苗的生产及管理工作。