适于鱿鱼肌肉组织中菌群特征分析的PCR-DGGE方法的建立

邓弘毅，王 月，丁林贤，王建玲，金 杨

(1.台州出入境检验检疫局，浙江 台州 318000;2.浙江师范大学，浙江 金华 321004)

鱿鱼，属软体动物的门头足纲，其肉质鲜美，风味与鲍鱼类似，国外有将鱿鱼加工成类似鲍鱼的罐头出售，因此鱿鱼又被冠以“穷人的鲍鱼”的美称，是广受欢迎的水产品之一［1］。但由于其水分含量高，蛋白质丰富，微生物含量较多，特别容易腐败变质，因此会引发一系列食品安全问题。目前关于食品中菌群特征方面的研究，国内外已有不少报道，但许多研究仍停留在传统的微生物鉴定法。由于自然界中有85%～99%的微生物至今还不可培养，因此传统的微生物鉴定法具有一定的局限性［2］。近年来，随着分子生物学的发展，越来越多的分子生物学手段被引入到食品微生物学的研究中。其中，基于传统PCR技术发展起来的PCR-变性梯度凝胶电泳 (DGGE)指纹分析技术就是一种可以有效避开微生物的分离培养阶段，直接从食品中提取总DNA，揭示样品中的微生物组成和动态变化的方法。

该方法首先由 Fischer等［3］于 1979年提出，1985年 Myers等［4］首次在 DGGE中使用 “GC夹板”和异源双链技术，使该技术日臻完善。目前，PCR-DGGE技术已广泛应用于环境微生物的微生物生态和种群群落的研究，并在食品领域尤其在水产品保鲜及加工中得到了一定的应用。如Hovda等［5］利用该技术对气调包装大马哈鱼中的优势菌群进行分析，发现传统以及改良的气调包装大马哈鱼中的优势菌群为磷发光杆菌、热杀索氏菌和假单胞菌属。Yoshikawa等［6］对大马哈鱼子酱发酵过程中的菌群情况研究时发现耐盐性酵母菌、假丝酵母等4种真菌是大马哈鱼子酱发酵过程中的优势菌群。

进行DGGE分析的首要问题就是样品中总细菌DNA的提取。作者以冻融法、匀浆法和摇床法3种方法处理鱿鱼样本，采用SDS法结合蛋白酶K法直接对鱿鱼组织中的细菌基因组DNA进行提取，建立了一套适合鱿鱼组织中菌落结构分析的方法，为进一步研究鱿鱼腐败机理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜鱿鱼为购自金华市果蔬水产批发市场的冰鲜鱿鱼，无菌水洗涤，室温放置至出现轻度腐败味时进行取样分析。

1.2 鱿鱼肌肉组织中细菌总DNA的提取

在无菌操作条件下将鱿鱼肌肉组织剪碎，称取6份10 g样品，采用冻融法、摇床法和匀浆法进行前处理，各方法均重复2次［7］。

1.2.1 冻融法

取10 g样品置于无菌离心管中，液氮处理2min后放于65℃水浴中保温至完全融化，反复冻融3次。将样品转移至无菌锥形瓶中，加入90mL无菌TE缓冲液，充分摇匀，静置5min，取上清液50mL，10000 r·min-1离心10min，待用。

1.2.2 匀浆法

取10 g样品置于无菌玻璃匀浆器中充分匀浆后转移至无菌锥形瓶中，加入90mL无菌TE缓冲液，充分摇匀，静置 5min，取上清液 50mL，10000 r·min-1离心 10min，待用。

1.2.3 摇床法

取10 g样品置于无菌锥形瓶中，加入10 g无菌玻璃珠和90mL无菌TE缓冲液，200 r·min-1、4℃振荡处理30min，静置5min，取上清液50mL，10000 r·min-1离心 10min，待用。

1.2.4 细菌总DNA的提取

3种处理后所得沉淀用10mL TE悬浮，加入0.5mL 10%SDS，50μL蛋白酶 K，混匀，37℃孵育 1 h。加入 1.5mL 5 mol·L-1NaCl，1.5mL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃孵育20min。用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，10000 r·min-1离心10min取上清，重复上述操作直至两相交界面无白色物质出现为止。取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，10000 r·min-1离心 10min。取上清，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置1 h，10000 r·min-1离心15min得到DNA沉淀。加入 700μL 75% 乙醇，70μL 3mmol NaAc漂洗 DNA沉淀后，溶解于1mL TE，-20℃保存。

1.3 16 S rDNA的PCR-DGGE图谱的构建

1.3.1 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR扩增

DNA用无菌水分别连续作3倍梯度稀释，进行PCR扩增。

PCR引物:8 F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’)和 1510 R(5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’)。

PCR反应体系:Primer 1μL，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，dNTP Mixture 5.0μL， DNA 1.0μL，TaKaRa Ex Taq 0.3μL 和 ddH2O 37.7μL。

PCR扩增程序:94℃预变性2min;94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环;最后72℃延伸2min。

1.3.2 16 S rDNA V3区片段的PCR扩增

PCR 引 物:GC357F(5’-CGCCCGCCGCG CGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGCCACCTACG GGAGGCAGCAG-3’) 和 517 R(5’-ATTACCGC GGCTGCTGG-3’)。

PCR反应体系:Primer 1μL，2×GC Buffer II 25.0μL，dNTP Mixture 8.0μL， DNA 1.0μL，TaKaRa La Taq 0.5μL 和 ddH2O 14.5μL。

PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性1min，55℃退火 1min，72℃延伸 1.5min，305个循环;最后72℃延伸5min。

1.3.3 DGGE图谱的建立与分析

DGGE电泳采用 Muyzer等［8］的方法，电泳条件为恒温60℃，电压85 V，聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8%，电泳时间14 h。电泳结束后，EB染液浸染15min，再用ddH2O漂洗5min，UVP凝胶成像系统照相。

2 结果与分析

2.1 鱿鱼肌肉组织细菌总DNA的提取

鱿鱼样品采用3种不同前处理后所提取的细菌总DNA电泳图如图1所示，结果表明经3种前处理方法后均能成功提取鱿鱼肌肉组织细菌的总DNA。其中，匀浆处理较其他2种处理所得DNA电泳条带要亮很多，说明匀浆处理提取DNA的产率最高。摇床处理次之，冻融处理提取DNA的产率最低。

图1 鱿鱼肌肉组织细菌总DNA提取电泳图

2.2 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR扩增

以提取的鱿鱼肌肉组织细菌总DNA及其相应的稀释梯度为模板，以8 F和1510 R为引物进行第1套PCR扩增，结果如图2所示，所得产物是大小约1500 bp的16 S rDNA片段，且随着稀释梯度的加大，条带亮度先增强后减弱。

2.3 细菌16 S rDNA V3区片段的PCR扩增

图2 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR扩增结果

以第1套PCR扩增产物为模板，以GC357 F和517 R为引物进行第2套PCR扩增，结果如图3所示，所得产物是大小约160 bp的片段。

图3 细菌16 S rDNA V3区片段PCR扩增结果

2.4 DGGE图谱的建立

用第2轮PCR扩增产物在变性梯度30%～60%进行DGGE电泳，结果如图4。由图4可知，DGGE共分离产生5条较明显的条带，3种方法所得图谱均相似，且都存在明显的主次带之分。

图4 细菌16 S rDNA V3区DGGE图谱

3 小结与讨论

PCR-DGGE方法避开了传统微生物培养分离的环节，直接提取微生物总DNA，获得种群的DNA信息，较为真实地揭示样品中微生物的实际组成，理论上只要实验条件适当，DGGE技术便可区分1个碱基差别的DNA片段［9］。但是，如何从样品中直接提取微生物总DNA，这是DGGE分析首先要解决的问题，可以说高质量和高产量的基因组DNA的提取是PCR-DGGE分析的前提和基础。一般来说，直接从鱿鱼组织中提取细菌DNA需要对样品进行前处理。前处理方法的不同可能会影响DNA提取的效果及后续的PCR扩增和DGGE分析。冻融法、匀浆法和摇床法3种前处理对鱿鱼组织中细菌DNA的提取效果及对DGGE分析影响实验的结果表明，匀浆处理提取DNA的产率最高，摇床处理次之，冻融处理最低。PCR-DGGE分析表明3种前处理形成的条带分布相似，且都存在明显的主次带之分，说明这3种前处理对后续PCR-DGGE分析的影响无明显差异。但是，就具体试验来说，摇床法和冻融法分别采用无菌锥形瓶和无菌离心管，所以能同时处理多个样本，而匀浆法在处理每一个样品时需对匀浆器进行灭菌，故该方法不适于处理大量样本。

鱿鱼是一类蛋白质含量丰富的水产品，100 g鱿鱼鲜品中的蛋白质含量就高达16～18 g［10］，杂蛋白一方面会影响DNA的溶解，另一方面也会干扰后续的PCR反应，因此尽可能的去除杂蛋白也是建立适于鱿鱼组织的DGGE分析方法的关键问题。一般来说，为获取高纯度的DNA样本都需要对DNA样本进行纯化，但是常用的DNA纯化方法容易导致DNA样本的严重损失，最终导致微生物多样性的下降。本试验通过简单的提高抽提次数并结合DNA稀释法，降低杂质在DNA模板中的浓度，获得了高质量的DNA样本，直接用于PCR扩增，有效避开了DNA纯化步骤，在很大程度上避免了DNA样本的流失，更为真实地反映待测样品中微生物的菌群特征。

［1］吴少杰，张俊杰，姚兴存，等.我国鱿鱼的综合加工利用现状与展望 ［J］.食品研究与开发，2011，32(1):154-156.

［2］辜运富，张小平，涂仕华.变性梯度凝胶电泳 (DGGE)技术在土壤微生物多样性研究中的应用 ［J］.土壤，2008，40(3):344-350.

［3］Fischer S G，Lerman L S.DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels:correspondence with melting theory ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1983，80(6):1579-1583.

［4］Myers R M，Fischer S G，Lerman L S，et al.Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Nucleic Acids Research，1985，13(9):3131-3145.

［5］Hovda M B， Sivertsvik M， Lunestad B T， et al.Characterisation of the dominant bacterial population in modified atmosphere packaged farmed halibut (Hippoglossus hippoglossus)basedon 16SrDNA-DGGE ［J］.Food Microbiology，2007，24(4):362-371.

［6］Yoshikawa S，Yasokawa D，Nagashima K，et al.Microbiota during fermentation of chum salmon(Oncorhynchus keta)sauce mash inoculated with halotolerant microbial starters:analyses using the plate count method and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) ［J］.Food Microbiology，2010，27(4):509-514.

［7］江芸，高峰，徐幸莲，等.冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响 ［J］.食品科学，2010，31(6):258-262.

［8］Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbialpopulations by denaturing gradientgel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700.

［9］Amann R I， Ludwig W， SchleiferK H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation ［J］.Microbiological Reviews，1995，59(1):143-169.

［10］陈意.鱿鱼的营养及食用价值 ［J］.食品与药品，2006，8(6):75.