石蜡切片人乳头瘤病毒6/11原位杂交的体会

王 珏，张 健，刘 涛

（1.湖北医药学院形态学实验室，十堰442000；2.湖北医药学院附属太和医院，十堰442000）

目前，随着医学技术的快速发展，人乳头瘤样病毒（human papillomavirus，HPV）6/11原位杂交检测技术在医学领域中已被逐渐推广应用，因其有着特异性强、敏感度高且定性定位准确的特点，使其在科研教学和临床外检中被广泛应用。此技术虽然简单，但操作却比较严格，否则会影响到检测结果，影响病理诊断，笔者通过反复实验观察，总结针对易出现问题的环节提出以下注意事项，以供大家参考。

1 材料与方法

1.1材料 40例疑似HPV感染患者均来自于本院病理科；原位杂交HPV6/11试剂购于福建泰普公司。

1.2方法 所有标本均经10%的中性福尔马林固定，常规脱水，透明，浸蜡，包埋。石蜡切片4μm厚，裱片于涂有γ-氨丙基三乙氧硅烷（3-Triethoxysilylpropylamine，APES）的防脱片载玻片上，常规脱蜡至水。

1.2.1组织消化 将切片放入杂交增强液中，微波高温消化15 min×2次，自然冷却后蒸馏水洗5 min×3次。

1.2.2组织杂交 ①滴加杂交液于组织上，盖上盖玻片，封口胶密封；②将切片放置于95℃的原位杂交仪中变性5 min后，再待温度下降到37℃时，孵育4～16h（此步骤在原位杂交仪中自动完成）；③柠檬酸修饰的磷酸缓冲液（citric acidcontaining phosphate buffer solutions，CPB S）中浸泡脱片，温度48～55℃，洗 5 min×3次。

1.2.3信号放大与显色 ①加一抗，37℃孵育30 min后，PBS（37℃）洗 3 min×3次；②加二抗，室温孵育20min后，PBS洗3min×3次；③加辣根过氧化酶（HRP）聚合物，室温孵育30min后，PBS洗 3 min×3次；④二氨基联苯胺（DAB）显色，镜下控制，苏木素复染，1%的盐酸乙醇分化，温水返蓝，中性树胶封片。

2 结果

40例标本，阳性38例，阳性率达95%，病变部位主要分布在表皮浅层的挖空细胞，胞核呈黄褐色的颗粒状，呈弥漫或散在分布，背景清晰，色差对比度强，见图1。

图1 HPV6/11原位杂交（DAB显色×400）

3 讨论

原位杂交是分子病理学领域里新开展的一项技术，其杂交原理是利用荧光、生物素、地高辛标记的探针，根据碱基配对的原理，与组织细胞中的核酸序列特异杂交结合，再经信号放大后显色来进行定性定位的，从组织固定到后期实验操作，必须注重每个环节，每个步骤都可能影响实验结果的客观性，因此在操作时，应注意以下几个方面。

组织和载玻片的处理：组织的固定最好用中性福尔马林，其优点在于除了能保持细胞的原始形态结构外，还能最大限度的保存细胞内的脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的水平，使探针能最大限度地进入细胞内且不会与蛋白质产生交叉连接反应；载玻片经清洁液浸泡24 h后，流水冲洗，再经200℃高温烤干，然后涂APES胶，自然风干后待用。这样处理载玻片是因为原位杂交的每个步骤都离不开水环境，经过处理后的载玻片，除了防止组织脱片外，还可以除去玻片表面的污渍，提高玻片透明度，便于光的折射，这些都是做好原位杂交的基础。

消化和杂交：这些步骤主要与反应的时间、温度和浓度等关系密切。消化的目的是提高组织的渗透性和探针的穿透力，便于探针和细胞内的核酸杂交，增强其阳性信号，降低背景着色，为杂交创造条件。笔者的经验是经微波高温15 min×2次，注意中途添补液体，以防干片造成非特异性结合，出现假阳性；杂交的条件最好控制在95℃，变性5 min，然后在37℃环境中孵育4～16 h左右，在杂交仪中放入保湿物，以保证试剂不被蒸发干；消化和杂交的时间过长，或温度和浓度过高都会破坏组织细胞的核酸的形态结构，但反之则会降低探针对细胞的穿透力，使杂交受阻，减弱低拷贝数病毒的检出率。漂洗切片的PBS缓冲液的pH值应在7.4～7.6之间，温度在48～55℃之间最佳，只有在此环境里操作，才能有效地降低背景着色，提高反差效果，这是实验成败的关键步骤。

信号放大与显色：放大信号则是在杂交结合的基础上，经过一抗二抗和HRP聚合物的共同作用下逐步形成的，起着定位定性的关键作用，若作用时间和环境温度过高，则易造成非特异性染色，可能造成假阳性；若时间和温度过低，则会是阳性信号减弱，甚至消失；DAB显色则是在了解其原理的基础上，凭着丰富的实践经验在显微镜下观察控制，笔者的经验是在见到表皮浅层出现黄褐色颗粒状就立即终止显色，再经流水冲洗，最后苏木素复染，1%盐酸乙醇分化片刻，切忌时间不宜过长，否则苏木素会覆盖黄褐色的阳性信号，造成主次颠倒的后果。

综上所述，原位杂交技术操作的步骤是固定不变的，但每一个人的操作都可能存在差异，因此只有规范操作，并分析实验结果成败的原因，才能得到准确，客观的实验结果，从而给临床病理诊断提供重要的参考依据。