箬叶多糖对乳腺癌免疫抑制作用的实验研究

王恩军， 刘红霞， 党志勇， 靳 祎， 郭晓军， 李术娜， 李 锦

（1.河北大学，河北保定071000；2.河北农业大学，河北保定071000；3.秦皇岛市中医院，河北 秦皇岛 066000）

箬叶多糖对乳腺癌免疫抑制作用的实验研究

王恩军1， 刘红霞1， 党志勇1， 靳 祎1， 郭晓军2， 李术娜2， 李 锦3

（1.河北大学，河北保定071000；2.河北农业大学，河北保定071000；3.秦皇岛市中医院，河北 秦皇岛 066000）

目的 观察箬叶多糖对移植性乳腺癌荷瘤小鼠的抑制作用及免疫调节机制。方法 采用TA2小鼠的乳腺癌MA737细胞移植模型，设正常组、肿瘤模型组、阳性对照组 （环磷酰胺 25 mg/kg）、箬叶多糖高剂量组 （200 mg/kg）、箬叶多糖中剂量组 （100 mg/kg）、箬叶多糖低剂量组 （50 mg/kg）及箬叶多糖中剂量组 （100 mg/kg）联合环磷酰胺 （25 mg/kg）组，通过瘤质量测定箬叶多糖体内抗乳腺癌活性，并通过淋巴细胞转化试验、巨噬细胞吞噬试验测定荷瘤小鼠淋巴细胞、巨噬细胞功能的变化。结果 箬叶多糖中、高剂量组及箬叶多糖联合环磷酰胺组灌胃处理后，一般情况有所改善，瘤质量减轻，增加小鼠脾指数 （P＜0.05），并促进淋巴细胞转化，提高巨噬细胞的吞噬能力 （P＜0.05）。结论 箬叶多糖对体内乳腺癌小鼠具有很好的抑制作用，并能增强机体免疫功能，且与环磷酰胺合用时还有增效减毒的作用。

箬叶多糖；乳腺癌；免疫；抑制作用；MA737

箬叶是禾本科植物箬竹Indocalamus tessellatus（Munro）Keng f.的叶，有特殊清香气味，叶片宽大，常用来包粽子。《本草纲目》中记载其性味甘、寒，归肺、肝经，有清热止血、解毒消肿、治衄血、便血、崩漏、喉痹等功效［1-3］，现代药理学实验表明箬叶具有抗炎、防腐、抗溃疡、抗艾滋病病毒及抗肿瘤等作用［4-6］。箬叶中含有多糖、茶多酚、氨基酸、维生素等成分。近些年，越来越多的研究表明多糖对人体具有极大的利用价值，本实验采用TA2小鼠的乳腺癌MA737细胞移植模型，对箬叶多糖体内抗乳腺癌活性及机制进行了研究，为将其开发为临床抗癌辅助药物提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与药品箬叶购于江西省九江市，经河北大学中医学院梁先茂副教授鉴定为禾本科植物箬竹的叶；刀豆素蛋白 （ConA）及四甲基偶氮唑盐 （MTT）购自Sigma公司，环磷酰胺购自山西普德药业 （批号20081023），RPMI-1640培养基及二甲基亚砜 （DMSO）购自GIBCO公司。

1.2 实验动物与肿瘤细胞株 健康TA2小鼠，4～5周龄，20～24 g，雌性，由河北农业大学动物科技学院提供。瘤株：MA737小鼠乳腺癌细胞株，由河北农业大学生命科学学院生物制药系惠赠。

1.3 实验方法

1.3.1 箬叶多糖的提取 提取方法为热水浸提法，经苯酚-硫酸法测定，其多糖质量分数为49.08%。

1.3.2 建立小鼠乳腺癌模型 处死荷瘤种鼠，在无菌条件下取2～3 mm瘤组织块 （约含3×106个MA737细胞），植于小鼠右侧背部皮下，建立小鼠乳腺癌实体瘤模型。

1.3.3 实验分组及给药 将接种72 h后的小鼠48只随机分为6组，每组8只。实验设肿瘤模型组 （生理盐水）、阳性对照组 （环磷酰胺 25 mg/kg）、箬叶多糖低剂量组（50 mg/kg）、中剂量组 （100 mg/kg）、高剂量组 （200 mg/kg）、箬叶多糖中剂量 （100 mg/kg）联合环磷酰胺（25 mg/kg）组，另取8只未接种小鼠作为正常对照组 （蒸馏水）。蒸馏水、生理盐水、箬叶多糖采用灌胃给药，环磷酰胺采用皮下给药，均为每天1次，剂量为0.1 mL/10 g，连续14 d。每日记录各组小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等体征。

1.3.4 肿瘤抑制率和脾脏指数的测定 末次给药后24 h处死小鼠，称定质量。剖取各组小鼠的肿瘤组织及脾脏，并称定质量，计算小鼠的肿瘤抑制率和脾脏指数。

肿瘤抑制率 （%）=（1－给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%

脾脏指数 （mg/10 g）=（脾脏质量/小鼠体质量）×10

1.3.5 淋巴细胞转化试验 采用MTT法，参考文献［7］在无菌条件下摘取脾脏，制成脾细胞密度为5×105个/mL的悬液，并加入到培养板中，每孔100 μL，随后加入终质量浓度5 μg/mL的ConA溶液100 μL，并设相应对照孔。于CO2培养箱中培养68 h，各孔加入MTT（5 mg/mL）液20 μL，再培养4 h，离心弃上清，各孔加入DMSO溶解，酶标仪测定A值 （波长为570 nm）。

1.3.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验 参照文献 ［8-9］，小鼠分组及给药情况同上。小鼠预先在试验前72 h腹腔内注射淀粉肉汤培养基，试验当天，在腹腔内注射Hank's液后轻揉腹部，随后处死小鼠，收集腹腔内混匀的液体。取2～3滴于载玻片上，加等量的鸡红细胞悬液混匀。置于37℃水浴，用生理盐水漂洗后干燥，瑞氏染色，观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况，计算吞噬指数及吞噬百分率。

1.4 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件包进行数据分析，实验数据以±s表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察结果 正常对照组小鼠饮食正常，无明显增减，毛发有光泽，精神状态良好，活跃。肿瘤模型组小鼠在给药后期出现饮食量减少，毛发无光泽，精神萎靡，活动量减少。箬叶多糖中、高剂量组和箬叶多糖联合环磷酰胺组小鼠饮食、毛发、精神状态和活动情况与正常对照组比较无明显变化，仅有个别小鼠在给药后期因肿瘤增大影响活动。

2.2 对荷瘤小鼠抑瘤率和脾脏指数的影响 100 mg/kg，

200 mg/kg箬叶多糖组瘤质量均低于肿瘤模型组，抑瘤率随剂量的增加而增强；同时与肿瘤模型组相比，100 mg/kg，200 mg/kg箬叶多糖可显著提高小鼠脾脏指数 （P＜0.05）。箬叶多糖与环磷酰胺联合使用，与环磷酰胺组相比，瘤质量降低，脾脏指数增加 （P＜0.05）。见表1。

表1 箬叶多糖对荷瘤小鼠体质量、瘤质量、抑瘤率及脾指数的影响

2.3 对荷瘤小鼠脾淋巴细胞功能的影响 肿瘤模型组小鼠T淋巴细胞增殖明显低于正常对照组 （P＜0.01），经箬叶多糖灌胃后可显著增强T淋巴细胞体外增殖能力，高剂量组的T淋巴细胞增殖能力接近正常水平。箬叶多糖联合环磷酰胺组小鼠的淋巴细胞增殖能力明显高于环磷酰胺组小鼠 （P＜0.05），见表2，提示箬叶多糖对环磷酰胺引起的淋巴细胞增殖能力下降有缓解作用。

2.4 对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 肿瘤模型组与环磷酰胺组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数显著降低；箬叶多糖高、中剂量组能显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力，与肿瘤模型组相比具有显著差异 （P＜0.05，P＜0.01），提高的程度与箬叶多糖的剂量呈正相关；箬叶多糖与环磷酰胺合用时能拮抗环磷酰胺对巨噬细胞吞噬功能的抑制，与环磷酰胺组比较具有显著差异 （P＜0.05）。

表2 箬叶多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞功能及巨噬细胞吞噬功能的影响

3 讨论

机体的免疫功能与肿瘤的发生有密切关系，当机体免疫功能低下或受抑制时，肿瘤的发生率增高。肿瘤发生后，机体可以通过免疫效应机制发挥抗肿瘤作用。这种免疫调节作用是目前公认的多糖抗肿瘤的主要机制之一［10］。本实验研究了箬叶多糖对小鼠移植性乳腺癌的抑制作用，结果证实箬叶多糖可以改善荷瘤小鼠的一般状态，减轻瘤质量，抑瘤率与剂量有一定的相关性，高剂量组的抑瘤效果更好。

脾脏指数是常用的衡量药物对脾脏的影响的指标，可以推测药物对机体免疫功能的影响［11］。本实验中，箬叶多糖中、高剂量组可显著提高小鼠脾脏指数，且增加的程度与箬叶多糖的剂量呈正相关性。箬叶多糖与环磷酰胺联合使用，脾脏指数较环磷酰胺组明显增加，说明箬叶多糖能够刺激脾脏的增长，对环磷酰胺引起的免疫抑制有一定的促进恢复的作用。

肿瘤免疫反应主要是细胞免疫，参与细胞免疫的效应细胞主要有细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞及巨噬细胞。本研究结果显示，箬叶多糖能明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，促进ConA诱导的淋巴细胞转化反应，可以提高荷瘤小鼠的免疫功能。与环磷酰胺联合使用，可以拮抗化疗药物的免疫损伤，可用于肿瘤的辅助治疗［12］。由此可见，箬叶多糖具有一定的抑瘤作用，这与它能改善免疫系统状态而增强机体抗肿瘤能力有关。

箬叶作为天然中草药，资源丰富，其多糖有效成分提取工艺成熟，毒副作用小，作为抗肿瘤辅助药物或功能食品具有良好的开发应用前景。

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R285.5

B

1001-1528（2013）04-0827-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.046

2012-09-25

河北省人口和计划生育委员会科研计划项目 （2010-A06）；保定市科技局科学技术研究与发展计划项目 （09ZF004）

王恩军 （1977—），男，硕士，主要从事抗肿瘤中药药理学研究。Tel：13833061977，E-mail：wangenjun2009@163.com