复方萸葛降糖颗粒的质量标准研究

顾娟娟，陆兔林，毛春芹，王 菊，胡颖菲，张 星

（南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046）

复方萸葛降糖颗粒由山茱萸、葛根、姜黄等多味中药经提取、加工、精制而成，具有清利活血，滋肾养阴的功效，临床上用于治疗Ⅱ型糖尿病心脑血管并发症。方中山茱萸滋肾养阴，葛根清热生津，两药合用，共为君药。山茱萸中主要成分为:环烯醚萜苷类和有机酸类等，其中以马钱苷为代表的环烯醚萜总苷能保护血管内皮细胞，对糖尿病血管并发症具有明显的改善作用［1］；葛根中主要成分为异黄酮类，异黄酮类成分中葛根素具有抑制蛋白质非酶糖基化，改善胰岛素抵抗的作用［2］；姜黄中主要成分为:挥发油类和姜黄素类［3］。为了有效控制复方萸葛降糖颗粒质量，本实验研究采用薄层色谱法对方中山茱萸、葛根和姜黄进行了定性鉴别，并采用高效液相色谱法测定本制剂中马钱苷和葛根素的量，综合评价制剂的内在质量。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)，包括:四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、VWD紫外检测器；WD-9403C型紫外分析仪(上海精胜科学仪器有限公司)；KQ-500E型医用超声清洗器 (昆山超声仪器有限公司)；AG285型电子分析天平 (梅特勒-托利多公司)。

马钱苷对照品 (批号:111640-201005)、葛根素对照品 (批号:110752-200912)、山茱萸对照药材 (批号:121495-200702)、葛根对照药材 (批号:121551-200902)、姜黄对照药材 (批号:121188-200502)均购自中国药品生物制品检定所；薄层色谱用硅胶G(青岛海洋化工有限公司)；复方萸葛降糖颗粒 (实验室自制，批号为:120213、120215、120217)；乙腈、甲醇为色谱纯；其他所用试剂为分析纯；水为石英双重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 山茱萸的薄层色谱鉴别［4-6］取本品颗粒2 g，研细，加20 mL乙酸乙酯，超声处理15 min，滤过，滤液挥干，加2 mL无水乙醇溶解残渣，即得供试品溶液。取山茱萸对照药材0.5 g，同法制备得对照药材溶液。另取熊果酸对照品，加无水乙醇制备成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取不含山茱萸的其他处方量饮片，按制备工艺制成缺山茱萸的阴性制剂样品，按供试品溶液制备方法制备，作为缺山茱萸的阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述溶液各5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (20∶4∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃下加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯365 nm下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置，显相同颜色荧光斑点，而阴性对照无此斑点，结果见图1。

图1 山茱萸的薄层色谱图Fig.1 TLC chromatogram of Corni Fructus

取本品颗粒2 g，研细，加30 mL乙醇，加热回流1 h，滤过，滤液挥至无醇味，加水溶解，过D101型大孔树脂 (内径1.5 cm，长10 cm)，水洗至无色，依次用30%乙醇，50%乙醇各50 mL洗脱，合并洗脱液，挥干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取山茱萸对照药材0.5 g，同法制备成对照药材溶液。另取马钱苷对照品，加甲醇制备成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取除山茱萸外的其他处方量饮片，按制备工艺制成缺山茱萸的阴性样品，照供试品溶液的制备方法制备，作为缺山茱萸的阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述溶液各5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸 (50∶10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置，显相同的紫红色斑点，而阴性对照无此斑点，结果见图2。

图2 山茱萸的薄层色谱图Fig.2 TLC chromatogram of Corni Fructus

2.1.2 葛根的薄层色谱鉴别［4，7］取本品颗粒2 g，研细，加20 mL甲醇，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，加1 mL甲醇溶解残渣，即得供试品溶液。取葛根对照药材0.8 g，同法制备成对照药材溶液。另取葛根素对照品适量，加甲醇制备成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取不含葛根的其他处方量饮片，按制备工艺制成缺葛根的阴性样品，照供试品溶液的制备方法制备，作为缺葛根的阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-水-甲苯 (13∶11∶2.4∶1.4)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯365 nm下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置，显相同颜色荧光斑点，而阴性对照无干扰，结果见图3。

图3 葛根的薄层色谱图Fig.3 TLC chromatogram of Puerariae lobatae Radix

2.1.3 姜黄的薄层色谱鉴别［8］取本品颗粒5 g，研细，加水100 mL，水蒸气蒸馏提取3 h，收集所得挥发油，用少许乙醚冲洗挥发油提取器管壁，乙醚液合并至所得挥发油中，所提的挥发油用乙醚振摇提取两次，每次10 mL，合并乙醚振摇提取液，低温挥干乙醚，残渣加甲醇1 mL使之溶解，作为供试品溶液。另取姜黄对照药材1 g，同法制备成对照药材溶液。再取除姜黄外的其他处方量饮片，按制备工艺制成缺姜黄的阴性样品，同法操作制备成缺姜黄的阴性对照溶液。照《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯 (9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置，显相同颜色斑点，而阴性对照无干扰，结果见图4。

图4 姜黄的薄层色谱图Fig.4 TLC chromatogram of Curcumae longae Rhizoma

2.2 定量测定

2.2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水 (10∶90)；检测波长240 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃。理论板数按马钱苷峰计算应不低于3000，按葛根素峰计算应不低于4000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取马钱苷对照品和葛根素对照品适量，加80%甲醇制成马钱苷和葛根素质量浓度分别为0.0618 mg/mL和0.4100 mg/mL的混合溶液，作为混合对照品贮备溶液。精密吸取上述混合对照品贮备溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品颗粒，研细，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按本品处方及制备工艺分别制备缺山茱萸及缺葛根的阴性样品，照2.2.3项供试品溶液的制备方法处理，即得缺山茱萸及缺葛根的阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.2.1项色谱条件进行色谱分离，记录色谱图，结果见图5。结果表明，本色谱条件下，供试品溶液中其他成分与马钱苷和葛根素分离良好，阴性对照色谱图中马钱苷峰和葛根素峰处不出峰，对测定结果无干扰。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取上述混合对照品贮备溶液1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。分别精密吸取上述6个质量浓度的混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，重复两次，按2.2.1项色谱条件测定马钱苷和葛根素的峰面积值。以质量浓度为横坐标，测得的峰面积平均值作为纵坐标，进行线性回归，分别得马钱苷线性方程:Y=17736X－3.3468，r=0.9993，葛根素线性方程:Y=33790X－62.094，r=0.9994，结果表明马钱苷、葛根素分别在0.0618 ～0.6180 μg、0.4100 ～4.1000 μg的质量范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图5 混合对照品(A)、供试品(B)、缺葛根阴性对照(C)和缺山茱萸阴性对照(D)的HPLC图谱Fig.5 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，sample(B)，negative sample without Puerariae lobatae Radix(C)，and negative sample without Corni Fructus(D)

2.2.7 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液(马钱苷和葛根素质量浓度分别为0.0618 mg/mL、0.4100 mg/mL)10 μL，在上述色谱条件下连续进样6次，测定马钱苷、葛根素的峰面积值，结果马钱苷和葛根素峰面积值的RSD分别为0.33%、0.35%。

2.2.8 稳定性试验 取批号为120215的颗粒样品，按2.2.3项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，取上述溶液分别于0、2、4、6、8、12 h进样10 μL，测定马钱苷、葛根素的峰面积值，计算其RSD分别为2.13%、1.35%，结果表明:本供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取批号为120215的颗粒样品，按2.2.3项供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μL，测定马钱苷、葛根素的峰面积值，计算得马钱苷的平均质量分数为1.41 mg/g，RSD为0.84%；葛根素的平均质量分数为13.89 mg/g，RSD为0.70%。

2.2.10 准确度试验 精密称取批号为120215的颗粒样品0.25 g，共9份，分别置具塞锥形瓶中，再精密加入质量浓度为0.3450 mg/mL马钱苷、3.4000 mg/mL葛根素混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各平行3份，照2.2.3项供试品溶液的制备方法制备样品，取10 μL样品溶液，注入液相色谱仪，色谱条件同前，记录色谱图中马钱苷和葛根素的峰面积，计算加样回收率。结果见表1与表2。

表1 马钱苷准确度试验结果Tab.1 Results of recovery tests of loganin

2.2.11 样品测定 取3个批次的样品，按2.2.3项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每批样品平行3份，进样测定，计算样品中马钱苷及葛根素的质量分数，结果见表3。

表2 葛根素准确度试验结果Tab.2 Results of recovery tests of puerarin

表3 样品马钱苷和葛根素测定结果(n=3)Tab.3 Determination of loganin and puerarin in Compound Yuge Jiangtang Granules(n=3)

3 讨论

3.1 在鉴别山茱萸中马钱苷时，首先参照《中国药典》方法直接用无水乙醇超声处理样品，结果供试品色谱中背景干扰强。针对山茱萸含有可溶于水的环烯醚萜苷类化合物，用大孔树脂对总苷进行分离、纯化。本实验研究比较了3种不同展开系统在山茱萸薄层色谱鉴别中的展开效果，展开系统Ⅰ为乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸 (50∶10∶1)；展开系统Ⅱ为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (40∶5∶10∶0.2)；展开系统Ⅲ为二氯甲烷-甲醇 (4∶1)，结果在供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应位置，均显相同颜色斑点，阴性对照均无干扰，其中以展开系统Ⅰ分离效果最好。

3.2 通过紫外全波长扫描的光谱图可知，马钱苷在240 nm处有最大吸收，葛根素在250 nm处有最大吸收。考虑葛根素在240 nm处吸收也较强，故选择240 nm作为检测波长。

3.3 本实验考察了不同溶剂系统，如甲醇-水、乙腈-水对色谱峰分离效果的影响。结果表明以不同比例的甲醇-水为流动相的分离效果均不理想，以乙腈-水 (10∶90)为流动相分离效果好。本实验也曾尝试用乙腈-水进行梯度洗脱，虽然可将待测组分完全分离，但并未缩短分析时间，且成本增加，故最终选择乙腈-水 (10∶90)作为流动相。

3.4 为了充分提取复方萸葛降糖颗粒中的有效成分，本实验研究考察了超声提取和回流提取两种不同的提取方法。结果表明:两种提取方法的提取效率均可，但超声提取相对操作简便、快捷，故本实验研究确定以超声处理作为提取方法。参照《中国药典》(2010年版一部)及相关文献［4，9-15］中山茱萸及葛根的提取方法，考察不同提取溶剂(30%、50%、80%、100%甲醇及 30%、50%、70%乙醇)对马钱苷及葛根素量的影响，结果表明两者以80%甲醇作为提取溶剂时的提取效率最高，所以采用80%甲醇作为提取溶剂。同时本实验研究还考察了不同超声时间 (15、30、45 min)对两者的影响，结果表明超声30 min和45 min二者的量差别不大，故确定供试品溶液制备方法采用超声提取30 min。

［1］郝海平，许惠琴，朱 荃，等.环烯醚萜总苷对糖尿病血管并发症大鼠NO、NOS和ET的影响［J］.南京中医药大学学报，2003，19(3):157-159.

［2］杜道辉，刘亚明.葛根有效成分治疗2型糖尿病及其并发症的研究进展［J］.中华中医药学刊，2008，26(10):2157-2160.

［3］吴宏伟，李洪梅，唐仕欢，等.姜黄药效物质基础研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2011，18(2):104-106.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［5］郭巧技，肖丽和，熊 英.降糖宁胶囊的薄层色谱鉴别［J］.中国药师，2010，13(3):444-445.

［6］刘 元，文志云，宋志钊，等.TLC法定性鉴别千斤脑康宁胶囊中5味中药［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15(11):17-18.

［7］盛 蓉，王江林，呼 梅，等.尿畅舒胶囊质量标准研究［J］.中成药，2008，30(6):875-878.

［8］王 宁，何 伟，朱立俏.芪贞舒痞颗粒质量控制方法的研究［J］.中国中药杂志，2005，30(2):151-153.

［9］陈学艳，王 艳，李 晶，等.山茱萸不同炮制品中莫诺苷和马钱苷含量测定［J］.天津中医药，2010，27(3):254-256.

［10］宋平顺，王兰霞，丁永辉.HPLC测定山茱萸不同炮制品中马钱苷的含量［J］.中成药，2008，30(5):707-708.

［11］魏惠珍，邱伟华，饶 毅，等.HPLC法测定六味地黄片中马钱苷和丹皮酚［J］.中草药，2010，41(3):405-407.

［12］戎欣玉，邵文亮，马 燕，等.HPLC法测定参葛颗粒中葛根素的含量［J］.中草药，2004，35(9):1013-1014.

［13］顾 艳，何 华，罗兴洪.HPLC测定通脉胶囊中葛根素的含量［J］.中成药，2007，29(5):12-13.

［14］许宏伟，梁文能，陈若筠.高效液相色谱法测定加味葛根片中葛根素的含量［J］.时珍国医国药，2002，13(8):468-469.

［15］徐 强，章曙丹，冯 瑛.HPLC测定糖肾颗粒中葛根素的含量［J］.中成药，2007，29(4):621-623.