实时荧光定量法检测晚期NSCLC恶性胸腔积液及血液肿瘤细胞EGFR基因突变的研究

(江西省肿瘤医院，南昌330029)

吉非替尼和厄洛替尼是目前已批准用于一线治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向药物，但这两种药物均依赖于患者表皮生长因子受体(EGFR)突变的存在与否，ASCO于2011年4月11日发布临时性临床指导意见，要求患者在使用TKI药物前需进行EGFR检测。目前，检测EGFR突变的金标准为直接测序法，其敏感度较低，为10% ～20%，且仅用于组织标本的检测。本研究旨在探讨晚期NSCLC患者在难以取得手术组织的情况下，应用实时荧光定量PCR扩增胸腔积液及血液中肿瘤细胞EGFR基因是否可准确判断其突变的存在与否，进而指导患者是否采取TKI治疗。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年1月～2011年12月江西省肿瘤医院内二科NSCLC腺癌患者76例，男27例、女49例，年龄52～77岁。均经病理确诊，根据2011年NCCN指南肺癌TNM分期标准，均为Ⅳ期患者，均合并恶性胸腔积液，未接受过TKI类药物治疗。

1.2 方法

1.2.1 标本的收集 同时收集入选患者的3种标本，即组织石蜡切片、外周血、胸腔积液。A:收集活检的肿瘤组织石蜡切片置于4℃冰箱保存待测，组织切片来源包括支气管镜下活检组织及CT引导性经皮肺穿刺活检组织，均经我院病理科诊断为肺腺癌。B:组织经病理确诊后，清晨空腹抽取患者外周静脉血4 mL，置于洁净的乙二胺四乙酸抗凝管中，后按照血液RNA抽提标准操作提取RNA。C:组织经病理确诊后，收集100 mL以上胸腔积液，以8 000 r/min离心5min，取沉淀;按照组织RNA抽提标准操作规程抽提。

1.2.2 基因组 DNA提取 提取组织 DNA采用TakaRa DEXPAT试剂盒。将3～5片10μm厚的石蜡切片放于Eppendorf管中，加入DNA抽提液10滴，充分混匀，100℃加热10 min，13 000 r/min离心10 min，吸取其上清直接用于实时荧光定量PCR反应。胸腔积液样本离心后收集细胞团，经研磨，Trizol-氯仿分层，取上清，异丙醇沉淀，以75%乙醇洗涤，再次离心，干燥，DEPC水溶解沉淀后获取组织RNA，RNA经紫外分光光度计质控后方可使用。采用ABI9700 PCR仪逆转录后获得cDNA，用于实时荧光定量PCR反应。外周血样本加入3倍体积红细胞裂解液后离心，Trizol-氯仿分层后处理同胸腔积液，提取RNA用于后续实验。

1.2.3 荧光定量PCR法分析NSCLC患者组织中EGFR 19～21突变情况 反应体系包括:模板50 ng、正反向引物各 25 pmol、Master Mix及 Taqman标记探针。每次试验均设定各突变的阴、阳性对照孔及空白对照孔。反应循环参数为:50℃ 2 min，95℃10 min;95℃ 15 s，62℃ 34 s，循环40次。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成纯化。引物序列:18外显子:上游:5'-GGCGTGGAAACAGACATAGAA-3';下游:5'-TGGAGTTCCCAAACACTCAG-3'。19外显子:上游:5'-ATTCGTAGGAGCCCAACAG-3';下游:5'-GCCAGTAATTGCCTGTTTCC-3'。20外显子:上游:5'-CTCTCCCACTGCATCTGTCA-3';下游:5'-GATGGGACAGGCACTGATT-3'。21 外显子:上游:5'-GTCAGCAGCGGGTTACATCT-3';下游:5'-AAGCAGCTCTGGCTCACACT-3'。

1.2.4 结果判定 以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值。没有出现扩增曲线或Ct=0的样本为阴性样本;出现扩增曲线且Ct≤34.0的样本为阳性样本;34.0≤Ct≤38.0的样本为可疑阳性，需重复;Ct＞38.0为阳性。另外，每次PCR结束后，将PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测，排除假阴性。18号外显子:2155碱基G→A;19号外显子:2235-2249碱基，碱基缺失;20号外显子:2369碱基C→T;21号外显子:2573碱基T→G。标本出现任一突变阳性均记为该标本阳性。

1.2.5 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件，采用χ2检验进行组间的两两比较，小样本量采用Fisher确切概率法进行统计学分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量PCR结果 76例NSCLC的EGFR外显子18～21中，共检测出27例有反应峰，其中外显子19缺失突变阳性的样本17例，外显子21为7例，突变率分别为22.3%和9.21%(图1)，而外显子20突变未检测到。

图1 阳性组织的扩增曲线

2.2 3种组织EGFR突变检测结果 见表1。外周血、胸腔积液与肿瘤组织的符合率达到80%(24/27、25/27)以上，检验结果表明这3种标本来源对EGFR检测的突变差异无统计学意义(P均＞0.05)，其中有2例呈现穿刺组织检测阳性而胸腔积液未检出，3例穿刺组织阳性而外周血阴性，1例呈现胸腔积液检测阳性而穿刺组织及外周血未检出，2例标本在穿刺组织中同时存在外显子19、21突变。

表1 3种不同标本EGFR突变检测结果(例)

3 讨论

目前，EGFR-TKI药物已广泛应用于肺癌的治疗，但其靶点突变检测却仍处于较低水平。IPASS研究表明，吉非替尼一线治疗EGFR突变阳性患者的有效率明显高于无突变的患者［1］，但是如不先进行EGFR检测而直接使用TKI药物，则死亡风险提高约185%［2］。因此，使用TKI药物前快速准确进行EGFR检测至关重要。

EGFR是erbB酪氨酸激酶受体家族的成员之一，作用机制为通过与配体如EGF、TGF-α结合，形成同源或异源二聚体，随后发生自身磷酸化，激活其下游的信号通路。EGFR基因位于人类7号染色体短臂7p12-14，由28个外显子组成，其酪氨酸激酶功能区由外显子18～24编码［3］;我国 NSCLC患者EGFR基因突变率约为34%，主要发生在外显子19～21，占所有突变的 90%以上［4］。因此，准确检测这4个突变基因即可基本了解是否存在EGFR基因突变。

70%～80%的NSCLC患者在确诊时即已处于ⅢB～Ⅳ期，丧失手术机会，无法获得手术标本，限制了TKI药物在临床的使用。本研究结果显示，3种来源的标本进行EGFR突变检测均可有效反映患者机体状态;提示在难以获取患者病理切片时，可采用外周血及胸腔积液进行EGFR基因突变检测以协助诊断;但需要指出的是，本研究在样本量不大的情况下，仍出现2例胸腔积液标本出现假阴性。因此，我们认为在能取得病理组织的情况下，组织切片标本仍为评估原发肿瘤突变性的最佳方案，以排除假阴性的可能。

本研究发现，EGFR基因存在19/21外显子双突变的可能，双突变的存在必然引起整个基因空间结构的变化，使得下游信号通路激活变化，这一类患者在应用TKI药物时疗效如何，对总生存期及无进展生存期影响如何，尚需进一步研究。

本研究中，1例患者胸腔积液存在21号外显子突变，但外周血及穿刺组织未见突变，提示肿瘤突变存在部位异质性。国内外资料证实，EGFR基因突变存在异质性主要表现为两种，一是转移部位与原发部位的不一致，二是治疗(主要指化疗)干预后肿瘤病灶EGFR检测的变换。突变异质性的发现解释了某些多处转移患者在接受TKI治疗后原发灶和转移灶对药物应答的不一致性，也解释了某些化疗前检测EGFR基因突变阴性的患者在接受规范化化疗后突变检测阳性的现象，为临床用药提供了有益的指导。

综上所述，应用实时荧光定量PCR方法检测胸腔积液及外周血中肿瘤细胞的EGFR基因突变，可以较准确地反映NSCLC患者的EGFR突变情况，耗时短，损伤小，标本易得且经济实惠，值得临床推广。但是由于存在假阴性的可能以及肿瘤异质性的存在，仍建议在送检时多种标本兼顾。

［1］Fukuoka M，Wu YL，Thongprasert S，etal.Biomarker analyses and final overall survival results from a phaseⅢ，randomized，open-label，first-line study ofgefitinib versus carboplatin/paclitaxel in clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer in Asia(IPASS)［J］.JClin oncol，2011，29(21):2866-2874.

［2］Suzumura T，Kimura T，Kudoh S，etal.Reduced CYP2D6 function is associated with gefitinib-induced rash in patients with non-small cell lung cancer［J］.BMC Cancer，2012，12(1):568.

［3］Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al.Activatingmutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of nonsmall-cell lung cancer to gefitinib［J］.N Engl JMed，2004，350(21):2129-2139.

［4］Dong Q，Huang JS，Huang J，etal.Advance in targeted therapy for lung cancer and EGFR genemutations in China［J］.Tumor，2005，25(6):625-628.