旋光法研究L-半胱氨酸在食品加工条件下的稳定性*

叶丽君，黄雪松

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州，510632)

L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys;L-α-氨基-β-巯基丙酸)，比旋光度［α］20D=+6.5°(5 mol/L HCl中);L-Cys具有还原性基团巯基(—SH)，在中性或微碱性水溶液能被空气氧化成L-胱氨酸(L-Cystine，L-Cys-Cys)，酸性溶液较为稳定［1］。L-Cys是蛋白质、酶等生物活性物质的组成成分之一，具有多种生理活性［2－3］。在食品、药品中有抗氧化和防止非酶褐变作用，常用作抗氧化剂或营养强化剂。由于L-Cys在医药、食品、化妆品等行业中被广泛地运用，了解L-Cys其加工、贮运中稳定性或变化规律，对于发挥L-Cys的作用和保证有关产品的质量则极为必要。

检测L-Cys含量的方法主要有电分析化学法、高效液相色谱法、自动分析仪法、化学滴定法、旋光度法和紫外分光光度法等［4－5］。这些测定方法需要专门仪器，操作繁琐，难以测定L-Cys在相关产品、尤其在食品加工条件下的变化过程。本研究根据多组分旋光物质体系的旋光度具有加和性这一特性，测定LCys在常温下、有氧和无氧溶液、H2O2、NaHSO3存在下和不同温度下的旋光度变化，探讨L-Cys在加工过程中的变化规律，为加工过程中减少L-Cys的变化提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

WZZ-2B自动旋光仪，上海精密科学仪器有限公司;HH-4恒温水浴锅，江苏金坛市宏华仪器厂。L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cys·HCl，食品级，含量 ＞98%)，广东大地食用化工有限公司;L-胱氨酸(优级纯)，上海索莱宝生物科技有限公司;HCl，Na2HPO4，柠檬酸，H2O2，Na2SO3均为分析纯，广州化学试剂厂。

Mcllvaine缓冲溶液的配制，见参考文献［6］。

1.2 实验方法

1.2.1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值溶液中比旋光度的测定

称取5.00 g L-Cys·HCl于具塞试管中，分别加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine缓冲溶液，定容至25 mL。以相应的pH值缓冲溶液为空白调零，测定各个pH值下溶液的旋光度，并计算各自比旋光度和摩尔旋光度。

称取2.00 g L-Cys-Cys，用1 mol/L HCl定容至100 mL。取5 mL L-Cys-Cys溶液中，分别加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine缓冲溶液，定容至25 mL。以相应的pH缓冲溶液为空白调零，测定各个pH值下溶液的旋光度，并计算各自比旋光度和摩尔旋光度。

1.2.2 测定L-Cys在不同pH值下的旋光度

称取5.00 g L-Cys·HCl于具塞试管中，分别加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine缓冲溶液，定容至25 mL。在暴露于空气的条件下，每隔1 h测定各个pH值下溶液的旋光度，确定L-Cys最稳定时所对应的pH值。

1.2.3 溶液中溶氧对L-Cys旋光度的影响

分别称取5.00 g L-Cys·HCl于2支具塞试管中，各加入由1.2.2所确定的pH值且经过煮沸后冷却和摇晃5 min以充分溶氧的Mcllvaine缓冲溶液，分别定容至25 mL。在隔绝空气的条件下，每隔1 h，测定各自旋光度。

1.2.4 配制指定pH值的L-Cys溶液

称取5.00 g L-Cys·HCl于具塞试管中，加入由1.2.2所确定的pH值的Mcllvaine缓冲溶液，定容至25 mL。

1.2.5 H2O2对L-Cys旋光度的影响

在根据1.2.4所配制的的L-Cys溶液中加入0.1 mL 30%H2O2后、在隔绝空气的条件下，立即测定其旋光度，然后每隔5 min测定其旋光度。

1.2.6 NaHSO3对L-Cys旋光度的影响

在根据1.2.4所配制的的 L-Cys溶液中加入0.10 g NaHSO3，在暴露于空气的条件下，每隔1 h测定其旋光度。

1.2.7 温度对L-Cys旋光度的影响

将1.2.4所配制的的L-Cys溶液分别于60℃和100℃的恒温条件下，每隔15 min测定其旋光度。

1.3 旋光度、反应速率常数 k和半衰期 t1/2的计算［7］

根据旋光度的加和性，推导L-Cys和L-Cys-Cys两者的旋光度与各自浓度的计算公式分别为:

式中c0，c1和 c2分别表示 L-Cys的初始浓度，LCys-Cys和L-Cys-Cys的最终浓度的浓度(mol/L)，M摩尔比旋光度(其为比旋光度［α］和摩尔质量Mr的乘积)。

以c对t作图，所得函数曲线的斜率即为反应速率常数 k［mol/(dm3·h)］，即:

式中:c是L-Cys的浓度(mo/L);t是反应时间(h);a为所得函数曲线在纵坐标上的截距，为常数;t1/2为半衰期(h)。

2 结果与讨论

2.1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度

L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度变化结果分别见图1。由图1可知，L-Cys和L-Cys-Cys的比旋光度均随着pH值升高而降低，且其变化规律分别符合一次函数:［α］=－0.434(pH)－6.69(R2=0.985)和［α］= －11.73(pH)－192.6(R2=0.942)。t检验(P=0.01，n=6)表明，这2个方程可反映 L-Cys和 L-Cys-Cys随 pH值变化的规律［8］。因为L-Cys和L-Cys-Cys是具有酸碱两性的氨基酸，pH值不同，其电离度、分子构象不同，而分子构象决定旋光性物质的旋光度［9－10］，所以pH影响其比旋光度的大小。因此，在研究L-Cys和L-Cys-Cys时，不应忽略它们随pH值而变化的影响。

图1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度变化规律Fig.1 Specific rotation changes of L-Cys in different pH values

2.2 室温下L-Cys在不同pH值下的氧化破坏

由图2可见，pH 3.0～8.0时，随着时间的增加，L-Cys的浓度降低;L-Cys的氧化符合零级反应，即其反应速率与反应物的浓度无关［7］。根据式1和式2式计算L-Cys在pH 3.0～8.0缓冲溶液中的氧化动力学参数见表1。L-Cys的氧化属于非酶化学反应，应当符合质量作用定律。以L-Cys浓度c对时间t作图，得直线(如图2)。

图2 pH 3.0～8.0时L-Cys的氧化曲线Fig.2 Oxidation curves of L-Cys at pH 3.0～8.0

由表1可知，L-Cys在不同pH值下的氧化符合零级反应。其中在pH 3.0时，L-Cys的氧化反应速率常数最小，为 2×10－7mol/(dm3·h)，半衰期最长，为2.76×106h;在pH 4.0和pH 8.0时，L-Cys的氧化反应速率常数均达到最大，为9×10－7mol/(dm3·h)，是L-Cys在pH 3.0的缓冲溶液中的氧化反应速率常数的4.5倍，而半衰期分别为6.13×105h和6.23×105h。

表1 常温下L-Cys在不同pH值的缓冲溶液中的氧化动力学参数Table 1 Kinetic parameters of oxidation of L-Cys in different pH values at room temperature

2.3 溶液中溶氧对L-Cys氧化破坏的影响

溶液(pH 3.0)是否溶氧对L-Cys氧化的影响如图3所示。L-Cys在溶液中有氧和无氧时，其氧化破坏均符合零级反应。溶液中是否溶氧影响L-Cys浓度，但对L-Cys的氧化速率几乎无影响，二者氧化速率常数均为2×10－7mol/(dm3·h)，这可能是由于在有氧溶液中，L-Cys一开始便迅速与其中的氧气反应生成L-Cys-Cys，所以在溶液无氧时较有氧时的浓度高。同时有氧溶液中氧气几乎被耗尽，其体系近似于无氧溶液体系;而二者均是在隔绝外界氧气的条件下测定的(见1.2.3)，所以L-Cys在有氧和无氧溶液中的氧化速率常数相等。此外根据1.2.2和图2可知，即使L-Cys溶液在暴露于外界空气时测定，其氧化速率常数仍为2×10－7mol/(dm3·h)，由此推测L-Cys的氧化可能与溶氧速率有关。可见，在实际生产中，在pH 3.0、常温的体系中存在L-Cys，若避免加快溶氧速率的操作(如避免搅拌、隔氧等措施)，体系中的L-Cys可稳定存在。

图3 溶液中有氧无氧时L-Cys氧化曲线(pH 3.0)Fig.3 Oxidation curves of L-Cys in aerobic and anaerobic solutions(pH 3.0)

2.4 H2O2对L-Cys的氧化破坏

图4－(a)是pH 3.0、溶液中加入H2O2后L-Cys的氧化情况，即加入H2O2后，L-Cys溶液迅速被氧化成L-Cys-Cys;随时间增加、H2O2被逐渐消耗完，LCys浓度降低的速率减小。根据图4－(a)的曲线可见，在0～0.42 h时，体系中L-Cys的浓度变化接近一条直线。为便于比较，将0～0.42 h的L-Cys溶液氧化反应初期的数据按零级反应处理(见图4－(b))，L-Cys的氧化反应速率常数从未添加H2O2时(见表1)的2 ×10－7mol/(dm3·h)增加至9 ×10－6mol/(dm3·h)，反应速率是未添加H2O2的45倍，半衰期由2.76×106h减少至6.10×104h。这主要是因为过氧化氢的氧化还原电位Eθ(H2O2/H2O)=+1.77 V，而 O2的氧化还原电位 Eθ(O2/H2O)= +0.816 V，前者比后者大得多［11－12］。所以在本试验中，L-Cys溶液加入H2O2后是隔绝外界空气进行测定的，但是其氧化反应速率常数仍比未添加H2O2、暴露于外界空气时的大得多。

2.5 NaHSO3对L-Cys的氧化破坏

图5是pH 3.0、溶液中存在NaHSO3时L-Cys的氧化破坏情况。由图5和 图2可见，当溶液中添加NaHSO3后，L-Cys的氧化反应速率常数是未添时的10倍，为2×10－6mol/(dm3·h)，其半衰期为2.76×105h。可见NaHSO3对L-Cys氧化成L-Cys-Cys的反应具有促进作用。这主要是由于Eθ(L-Cys-Cys/LCys)=－0.34 V，而在酸性溶液中，HSO3－以H2SO3的形式存在，Eθ(H2SO3/HS2O4－)= －0.08 V，表明L-Cys的还原性大于 H2SO3。根据 Eθ(H2SO3/HS2)－ Eθ(L-Cys-Cys/L-Cys)=+0.26 V ＞ +0.2 V，体系中可能发生反应:2L-Cys+H2SO3→ L-Cys-Cys+HS2O4－+H2O+H+，从而促使L-Cys氧化成 L-Cys-Cys［11，12］。而在本试验中，加有 NaHSO3的L-Cys溶液在是暴露于外界空气下测定的，空气中氧气加上NaHSO3的双重氧化作用，使L-Cys的氧化速率常数增加。NaHSO3和L-Cys在食品生产中都可用作抗氧化剂［13］，据上述结果与分析可见，NaHSO3会加速L-Cys的氧化，不能作为保护L-Cys的抗氧化剂使用。

图4 H2O2存在时L-Cys氧化破坏曲线(pH 3.0)Fig.4 Oxidation curve of L-Cys in solution containing H2O2(pH 3.0)

图5 NaHSO3存在时L-Cys氧化降解曲线(pH 3.0)Fig.5 Oxidation curve of L-Cys in solution containing NaHSO3(pH 3.0)

2.6 温度对L-Cys的影响

根据旋光度的加和性可知，L-Cys被氧化生成LCys-Cys，其混合液总旋光度应减小。但由图6可见，pH 3.0、在加热条件下，L-Cys溶液的总旋光度不随时间增加而逐渐减小，而是出现无规律的变化。这说明在加热条件下，尤其是加热至100℃ 时，L-Cys不仅发生氧化反应生成L-Cys-Cys，而可能发生其他化学反应形成不同的物质，因而导致其旋光度出现不规律变化。L-Cys具有热不稳定性，其水溶液加热至100℃以上会发生热降解反应，根据溶液pH值不同生成不同物质，如160℃时，在pH 2.2时会主要生成噻吩硫醇、三噻环庚烯等，在pH 5.1和pH 7.1时则主要生成2-甲基三硫化合物［14－16］。在本实验条件下，虽然加热没超过100℃，但通过L-Cys溶液旋光度变化可知，L-Cys在加热至60℃时开始呈现不稳定性，不是只氧化生成L-Cys-Cys。当加热至100℃时，溶液总旋光度变化幅度更大，更无规律，说明L-Cys可能发生了热降解，生成了其他复杂的化合物而非单纯的L-Cys-Cys，所生成的其他化合物又有各自的旋光度，导致体系的总旋光度不如预期般逐渐减小。

图6 温度对L-Cys旋光度的影响(pH 3.0)Fig.6 The influence of temperature to optical activity of L-Cys(pH 3.0)

3 结论

L-Cys和L-Cys-Cys的比旋光度和pH值的关系呈极显著正相关，分别符合一次函数:［α］=－0.434(pH)－6.69(R2=0.985)和［α］= －1.73(pH)－192.6(R2=0.942)。在pH值3.0～8.0内，L-Cys的氧化反应符合零级反应，其氧化反应速率常数在pH 3.0时最小，在pH 4.0和pH 8.0时均达到最大。溶液中是否有氧会影响L-Cys的起始浓度，其浓度在无氧溶液中比在有氧溶液中高，但是不会影响其氧化速率常数。溶液中存在H2O2时使L-Cys的氧化速率常数增大，促进其氧化形成L-Cys-Cys。溶液中加入NaHSO3后，在空气中氧和 NaHSO3的双重氧化作用下，L-Cys溶液的氧化速率常数是未加NaHSO3的10倍，因此NaHSO3不能作为保护L-Cys的抗氧化剂。L-Cys具有热不稳定性，当加热至60℃时其溶液总旋光度开始出现无规律变化，其化学结构被破坏;当加热至100℃时，其溶液总旋光度变化更不规则，L-Cys可能发生热降解产生多种化合物。

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