嗜酸乳杆菌转化菜籽油生成共轭亚油酸条件的优化*

李垚，徐尔尼，杨欣，胡冰彬

(南昌大学生命科学与食品工程学院食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌，330047)

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是指一系列含有共轭双键、具有不同位置和空间的十八碳二烯酸同分异构体的混合物，其中最具有生理活性的异构体是 c9，t11 － CLA 和 t10，c12 － CLA［1］，它们具有多种营养和保健功能，如抗癌、减肥、抗动脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退等［2］。乳酸菌细胞膜上的亚油酸异酶具有将亚油酸转化生成CLA的能力，由于易培养、生成的异构体单一、反应条件温和、产量大、安全性高等优点，因此使用乳酸菌进行生物转化合成CLA已成为当前研究热点。

近几年利用微生物静息细胞转化生成CLA为众多研究者所关注，这是由于微生物细胞转化技术操作简单，在反应体系液中干扰物质少，不易染菌，更有利于下游的纯化和检测等优点，但寻找更为廉价的转化底物是当前重要的研究方向。菜籽油来源广泛，价格比亚油酸低廉，其中含有约20%的亚油酸，这些亚油酸在乳酸菌亚油酸异构酶作用下可转化生成附价值极高的CLA。

本文研究了转化液介质、介质浓度、pH、温度、时间、细胞浓度、金属离子等因素对嗜酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)CGMCC 1.1854静息细胞转化菜籽油生成CLA的影响，并利用Box-Benhnken中心组合设计和响应面法对菜籽油转化生成CLA的时间、pH、温度、细胞浓度进行了工艺条件的优化分析，以期达到提高CLA产量的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

嗜酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)CGMCC 1.1854，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 试剂

共轭亚油酸标准品 (含有c9，t11和t10，c12两种异构体，纯度≥99%)，Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯;菜籽油(酸价5.05，皂化值185)，来自江西婺源;亚油酸(纯度≥98%)，上海试剂一厂;猪胰脂肪酶(酶活≥10 000U/g)，上海博奥生物科技公司。

1.1.3 主要仪器

紫外/可见分光光度计(751)，上海分析仪器厂;恒温振荡器(THZ-C)江苏太仓市实验设备厂;低速大容量离心机(DL-5-B)上海安亭科学仪器厂;酸度计(PHS-25型)等。

1.1.4 MRS培养基

酪蛋白胨10.0 g、牛肉提取物10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二胺2.0 g、吐温 －80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO40.2 g、Mn-SO40.05 g、蒸馏水 1.0 L、pH 6.8，121 ℃ 灭菌 20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菜籽油的乳化［3］及水解处理［4］

称取1.26 g吐温-80和0.75 g司盘-80，混匀，然后70℃水浴2 min，再加入1.5 g菜籽油，逐渐滴入去离子水，形成油包水型乳化液，至菜籽油终浓度为75 mg/mL。超声乳化处理(300 W，超声5 s，间歇3 s，重复8次)，形成稳定的乳浊液，121℃灭菌20 min，4℃保存备用。

1.2.2 乳酸菌细胞的收集

从新鲜斜面挑取1环活化菌种接到150 mL MRS培养基中，37℃下静置培养20 h，即为种子液。按5%接种量接种至亚油酸含量为0.2 mg/mL MRS培养基中进行增殖诱导培养，37℃下静置培养18 h。培养液冷冻离心(4 500×g，25 min，4℃)，去上清液，沉淀细胞用无菌生理盐水洗涤1次，离心收集细胞，稀释至菌体细胞浓度为0.25 g/mL。

1.2.3 转化条件的优化

在转化介质液总体积为30 mL，菜籽油浓度为7.5 mg/mL，脂肪酶［5］的加入量为 2 mg/30 mL 基础上，将依次对转化液介质的成分、介质浓度、pH、温度、时间、细胞浓度、金属离子［6］7个因素进行研究。

1.2.3.1 转化介质及其浓度对CLA产量的影响

以0.1 mol/L pH 7.0的4种不同成分缓冲液作为转化液介质，即(1)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液［7］、(2)Na2HPO4-KH2PO4缓冲液、(3)K2HPO4-KH2PO4缓冲液［8］、(4)KH2PO4-NaOH缓冲液。转化细胞浓度为30 mg/mL，37 ℃，80 r/min，转化24 h，根据 CLA的生成量确定最适的转化液介质。

使用浓度分别为:0.05、0.1、0.15、0.2 mol/L pH 7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为转化介质，转化细胞浓度为30 mg/mL，37 ℃，80 r/min，转化24 h，检测在不同浓度的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中CLA含量，以确定最适转化液介质浓度。

1.2.3.2 转化液介质pH对CLA产量的影响

将收集到的细胞分别用 pH为:5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的 0.1 mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行悬浮，细胞浓度为30 mg/mL，37℃，80 r/min，转化24 h，检测各个转化液中的CLA含量，确定转化液介质的最适pH值。

1.2.3.3 转化温度对CLA产量的影响

在已确定缓冲液介质和pH的转化体系中，细胞浓度为 30 mg/mL，转化温度分别为:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 ℃，80 r/min，转化 24 h，检测各个转化液中的CLA含量，确定最适转化温度。

1.2.3.4 转化时间对CLA产量的影响

在已确定缓冲液介质和pH值的转化体系中，细胞浓度为30 mg/mL，35℃，80 r/min，转化反应时间分别为 16、20、24、28、32、36、40、44、48 h，检测各转化液中的CLA含量，确定最适转化时间。

1.2.3.5 细胞浓度对CLA产量的影响

在已确定缓冲液介质和pH值的转化体系中，将收集到的菌体细胞加入该体系中，至细胞终浓度分别为:8、15、20、30、40、50、70、100 mg/mL，35℃，80 r/min，转化24 h，检测各转化液中的CLA含量，确定最适转化细胞浓度。

1.2.3.6 金属离子对CLA产量的影响

一般低浓度的金属离子会促进亚油酸异构酶的活性，在已确定的反应体系中加入不同种类的金属离子(Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+)，使其浓度分别为1、2 mmol/L，然后检测各转化液中CLA产量，与未添加金属离子(H)的对照组转化液中CLA产量比较。

1.2.4 响应面法［9］优化转化工艺

根据单因素实验的结果，选择对亚油酸异构酶活性有显著影响的4个因素，即时间、pH值、温度、细胞浓度为自变量，以CLA产量为响应值，设计出4因素3水平的实验设计方案，如表1。

表1 各因素水平编码Table 1 Coding of factors and levels

1.2.5 共轭亚油酸的提取方法［10］

取2 mL转化液放入带盖试管中，加入10 mL正己烷，使用快速混匀器混合6 min，然后使用离心机5 000 r/min离心3 min，分成上中下，3层，用移液枪吸除下层水相，加入2 mL蒸馏水，混匀1 min，洗掉水溶性物质，离心分层，弃掉下层水相，然后把剩下的有机相和乳化层使用装有无水硫酸钠的滤纸过滤、吸水干燥，定容至25 mL容量瓶中。

1.2.6 共轭亚油酸的检测方法［11］

准确称取共轭亚油酸标准品，用正己烷溶解，配制成梯度溶液，在室温25℃下，以正己烷为参比溶液，检测233 nm处吸光值，以CLA浓度为横坐标，吸光值A233为纵坐标，建立CLA紫外检测标准曲线，如图1。

标准曲线的线性相关系数是0.999 5，为高度显著，线性范围是 1 ～7 μg/mL，检测限 1 μg/mL;将从转化液中提取到的正己烷溶液，以正己烷为参比，在紫外233 nm处检测吸光值，然后按照标准曲线换算出CLA含量。

图1 CLA紫外标准曲线Fig.1 Standard curve of CLA UV absorbance

2 结果与分析

2.1 转化液介质及其浓度对CLA产量的影响

选用了4种不同成分缓冲液作为转化液介质，即(1)柠 檬 酸-柠 檬 酸 钠 缓 冲 液［7］;(2)Na2HPO4-KH2PO4缓冲液;(3)K2HPO4-KH2PO4缓冲液［8］、(4)KH2PO4-NaOH缓冲液。由图2可以看出，最适转化介质是柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，CLA的生成量为104.78±6.2 μg/mL，这说明适量的Na+对嗜酸乳杆菌的亚油酸异酶活性有促进作用。图3结果显示，最适介质液浓度是0.1 mol/L，是由于离子浓度过低不适合进行酶反应，而高浓度的盐溶液，则会产生破乳现象，使菜籽油和水乳化不够充分，影响了酶反应。

图2 转化介质对CLA产量的影响Fig.2 Effect of conversion medium on the yield of CLA

2.2 转化液介质pH对CLA产量的影响

由图4可以看出，嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在5.0 ～8.5 之间都有酶活性，这和 Keper［12］等的报道基本一致。Lin［13］等对嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的研究表明，酶在pH 5时活性最大。图4结果显示，酶虽在pH 5时有活性峰值，但最适pH值是6.5，CLA的生成量为191.31±2.6 μg/mL，可能与本文使用的乳酸杆菌静息细胞进行转化，底物是菜籽油而不是亚油酸有关。

图3 介质浓度对CLA产量的影响Fig.3 Effect of medium concentration on the yield of CLA

图4 pH对CLA产量的影响Fig.4 Effect of pH on the yield of CLA

2.3 转化温度对CLA产量的影响

从图5可以看出，适宜的转化温度在31～35℃之间，其中35℃为最佳温度，CLA的生成量221.83±6.1 μg/mL。在20～30℃之间酶活力变化不大，超过40℃酶活严重失活，表明亚油酸异构酶热稳定性差，这和曹建［14］等人的研究结果基本一致。

图5 温度对CLA产量的影响Fig.5 Effect of Temperature on the yield of CLA

2.4 转化时间对CLA产量的影响

由图6结果显示，初始随着转化时间的延长，CLA产量不断增加，当转化至24h时，CLA产量达223.57±5.72 μg/mL，随着时间的延长，产量开始减少。这是由于CLA易氧化、稳定性不高会造成产量的下降，因此，24 h是最适的转化时间。

2.5 细胞浓度对CLA产量的影响

从图7可以看出，当细胞浓度达到40 mg/mL时，CLA的产量趋于稳定，达到232.04±5.27 μg/mL，细胞浓度与菜籽油浓度(7.5 mg/mL)最适比例为 5.3∶1。

图7 细胞浓度对CLA产量的影响Fig.7 Effect of cell concentration on the yield of CLA

2.6 金属离子对CLA产量的影响

一般低浓度的金属离子会促进亚油酸异构酶的活性，在反应体系中加入不同种类的金属离子(Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+)，使其浓度分别为 1、2 mmol/L。结果如图 8所示，1 mmol/L Ca2+和Cu2+对亚油酸异构酶活性有微弱促进作用，分别比对照组提高了0.35%和0.62%。2 mmol/L Zn2+和 Ca2+对亚油酸异构酶活性有较大促进作用，分别比对照组提高了2.40%和1.75%。Mg2+作用不明显，Fe2+、Mn2+和Fe3+都表现出了抑制作用，Fe3+的抑制作用最强。Cu2+一般是酶活性的抑制剂，而1 mmol/LCu2+对酶活性起到促进作用，可能原因是微量Cu2+可以大幅度促进菜籽油水解，有利于酶反应的进行，2 mmol/L Cu2+则明显起到了抑制作用。

图8 金属离子对CLA产量的影响Fig.8 Effect of metal ion on the yield of CLA

2.7 转化工艺的优化

试验设计与结果如表2所示。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results

以CLA产量(Y)为响应值，运用Design－Expert 8.0.6对实验数据进行多项式回归分析，得到如下二次多项式:

Y=332.04+22.75A－13.42B+5.75C+5.42D+29.97AB+9.54AC－19.34AD－10.53BC+13.60BD+15.86CD－68.92A2－42.73B2－11.71C2－35.42D2。

回归模型方差分析表如表3所示。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression equation

由回归方程和回归模型方差分析表3可以看出，此模型的 F值是 43.66，“Prob＞F”的 P值小于0.0001，表明该模型是有显著性意义的，能较好的解释CLA产量的变化，失拟项在P=0.05水平上不显著(P=0.242 2＞0.05)。在所选的因素内，对CLA产量影响排序为:时间＞pH＞温度＞细胞浓度。交互项AB、AD是极显著性因子，AC无显著性差异，说明时间和温度没有交互作用。由表4可看出，预测拟合度十分接近校正拟合度，说明模型是合理的，信噪比大于4为理想值，本模型信噪比是25.788，说明比值理想，本模型方程可以被用来解释设计方案。

表4 数学模型的统计结果Table 4 Statistical results of regression model

2.8 响应面图分析和最优转化工艺的确定

回归方程AB、AD交互项所做的响应面图。

图9 响应面图分析Fig.9 The chart of response surface analyse

两个图的响应曲面都有着明显的坡度，说明pH与时间，细胞浓度与时间都有着明显的交互作用，这和回归方程分析中的结果一致。

通过软件分析给出最优方案和CLA产量预测值。最优转化转化工艺:A=25.2 h，B=6.36，C=36.78℃，D=42.16 mg/ml，在此条件下CLA产量的理论值是236.26 μg/ml，考虑到实际操作和CLA易氧化的情况，实际实验中最优条件控制在A=25 h，B=6.5，C=36 ℃，D=40 mg/mL，在此条件下，通过 5次独立的试验，得到的CLA产量的实际值为230.12±7.52 μg/mL，试验值与预测值拟合较好，说明回归方程为转化合成CLA提供了一个合适的模型，验证了前述假定的可行性。

3 结论

本论文在菜籽油浓度为7.5 mg/mL，脂肪酶的加入量为2 mg/30 mL条件下，对嗜酸乳杆菌静息细胞转化菜籽油生成CLA条件进行了优化研究。通过单因素试验，确定了最适转化液介质是0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，得到了最适pH、温度、转化时间和细胞浓度参数。同时，研究了不同金属离子对亚油酸异构酶活性的影响，1 mmol/L Ca2+和 Cu2+对亚油酸异构酶活性有微弱促进作用，分别比对照组提高了0.35%和0.62%。2 mmol/L Zn2+和 Ca2+对亚油酸异构酶活性有较大促进作用，分别比对照组提高了2.40%和1.75%。在该基础上，利用Box-Benhnken中心组合设计和响应面法对转化时间、pH值、温度、细胞浓度进行了工艺优化分析，确定了最优转化时间25 h，pH6.5，温度36℃，细胞浓度40 mg/mL。在此优化条件下，CLA的产量可以达到(230.12±7.52)μg/mL。通过这个数据可以看出嗜酸乳杆菌转化菜籽油生成CLA是可行的，但CLA产量还有待于提高。今后我们可以通过诱变育种、细胞透性处理、酶激活剂等方法进行深入研究，使CLA产量更高。同时，结合固定化技术使细胞态的亚油酸异构酶可以得到重复、多批次利用，达到高效率、低成本生产的目的。另外，结合红外光谱法，高效液相色谱法，气相色谱法和质谱分析法，对CLA异构体和含量进一步分析，确定活性异构体的含量，为我们以后的研究奠定基础。

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