云南栽培玛咖芥子油苷提取工艺的优化*

郝利民，鲁吉珂，，巴建明，崔燕，白冰，姜月蒙

1(总后军需装备研究所军用汉麻材料研究中心，北京，100027)2(郑州大学生物工程系，河南 郑州，450001)3(解放军总医院内分泌科，北京，100853)

玛咖(Lepidium meyenii Walp.，Maca)，十字花科独行菜属1年生或2年生草本植物，玛咖地下根是其贮藏营养的主要部分［1］。玛咖原产于南美洲秘鲁海拔3 500 m的安第斯高寒山区，其栽培和食用历史悠久，作为药食两用植物，传统上主要用于抗疲劳、改善性功能和提高生育力等［2－3］。玛咖已成为当前功能食品研究的热点，秘鲁玛咖的出口额由2001年的141.5万美元增长到2010年的 617.0万美元［4］。2003年，我国云南成功引种玛咖［5］，近年来国内学者对玛咖研究报道逐渐增多［6］。冯颖等对云南栽培玛咖分析发现，其营养成分与秘鲁原产玛咖相当，具有较高的开发价值［7］。2011年，我国卫生部批准玛咖粉作为新资源食品。

芥子油苷(glucosinolate)也称硫代葡萄糖苷或硫苷，是一种含氮和硫的植物次生代谢物质，广泛分布于十字花科植物中［8］。芥子油苷在玛咖中含量丰富［9］，是玛咖生理活性成分之一。2002 年 Dini等［10］首次从玛咖根的甲醇提取液中分离得到了苄基芥子油苷(benzylglucosinolate)和间甲氧基苄基芥子油苷(m-methoxybenzylglucosinolate)，同时提出这2种芥子油苷可作为玛咖的化学标记。随后，研究者又分别从玛咖根中发现了一系列芥子油苷，并对其含量进行了检测分析［11－14］。2012 年 Gonzales［4］指出，由于苄基芥子油苷容易分解为异硫氰酸酯及其他一些小分子代谢物，其不能作为玛咖的化学标记。目前，关于玛咖功效物质的研究尚无定论，研究芥子油苷提取工艺，可为其分离纯化奠定基础，有助于判定玛咖化学标记物，这对于其生理活性研究及玛咖功能食品开发都具有重要意义。

本研究以云南栽培玛咖为原料，对其干根中芥子油苷提取工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玛咖干根，总后勤部军需装备研究所玛咖种植基地(云南丽江)，粉碎粒度150目;Sinigrin(黑芥子苷，≥99.0%)，美国英杰生命技术有限公司;氯化钯、甲醇，均为分析纯;羧甲基纤维素钠，化学纯。

Beckman高速离心机，美国Beckman公司;UV－1700紫外分光光度仪，日本岛津制作所;精密pH计(pHS－3C)，上海精密科学仪器有限公司;电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司;KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芥子油苷分析

芥子油苷标准曲线:准确吸取0.50 mmol/L黑芥子苷标准溶液 0.0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL 于 10 mL比色管中补加水到2.0 mL，再加入0.15%羧甲基纤维素钠溶液4.0 mL，充分摇匀，加入2 mL的PdCl2显色溶液，盖上塞子，再充分摇匀并于25℃下放置4 h，以水-PdCl2-羧甲基纤维素钠空白溶液为参比，540 nm下测定吸光值，绘制标准曲线［15］，见图1。

样品中芥子油苷含量测定:将定容的玛咖提取液稀释一定的倍数，准确吸取样液1.0 mL，按照上述方法显色，测定吸光值，并代入标准曲线求出不同浸提液中芥子油苷的含量。

图1 芥子油苷标准曲线Fig.1 Standard curve of glucosinolate

芥子油苷提取率/%=［浸提液中芥子油苷质量(g)/玛咖原料质量(g)］×100

1.2.2 提取溶剂选择

称取玛咖粉1.00 g，置于磨口锥形瓶中，按1∶20(g∶mL)料液比加入20 mL提取溶剂(分别为水、甲醇、乙醇和正己烷)，室温浸提24 h;水浸提液真空过滤，定容至100 mL，待测;甲醇、乙醇和正己烷浸提液真空过滤，滤液减压蒸馏浓缩，浸膏加水溶解，定容至100 mL。芥子油苷含量测定参照1.2.1。

1.2.3 玛咖芥子油苷提取单因素优化

称取玛咖粉1.00 g置于磨口锥形瓶中，加入一定体积甲醇，密封后水浴加热浸提，间歇振荡;浸提一定时间后浸提液真空过滤，滤液减压蒸馏浓缩，浸膏加水溶解，定容至100 mL。芥子油苷含量测定参照1.2.1。

影响玛咖芥子油苷提取率的主要因素为提取温度、提取时间、料液比，因此分别以这3个因素为对象，考察其对芥子油苷提取率的影响。

1.2.4 玛咖芥子油苷提取的正交实验

在单因素优化结果的基础上，以提取温度、提取时间、料液比为影响因素，各取3个水平，采用 L9(34)正交表进行正交实验设计，以芥子油苷的提取率为指标，确定玛咖芥子油苷的最适提取工艺。

1.2.5 玛咖芥子油苷超声提取工艺优化

称取玛咖粉1.00g置于磨口锥形瓶中，加入一定体积甲醇，密封后于室温下超声辅助提取;浸提20min后浸提液真空过滤，滤液减压蒸馏浓缩，浸膏加水溶解，定容至100mL。芥子油苷含量测定参照1.2.1。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂选择

天然产物中功效物质的提取常采用水、甲醇和乙醇等溶剂，首先对不同溶剂提取云南栽培玛咖芥子油苷的效果进行研究，结果见表1。不同溶剂对芥子油苷提取率影响较大，正己烷为溶剂时提取率较低，仅为0.077%;而采用甲醇溶剂时芥子油苷提取率可达到1.28%(表1)。甲醇对芥子油苷具有良好的溶解性，另外，甲醇可能对玛咖组织中可降解芥子油苷的黑芥子酶有抑制作用，从而保护芥子油苷避免被酶解。因此，采用甲醇作为芥子油苷的提取溶剂。

表1 不同溶剂提取芥子油苷结果Table 1 Extraction of glucosinolate with different solvents

2.2 水浴浸提单因素优化

2.2.1 提取温度对玛咖芥子油苷提取率的影响

温度是影响天然产物功效物质分离提取的主要因素之一，提高温度，分子运动加快，提取率升高;但高温会导致生物活性物质活性损失，同时高温操作使能耗增加，因此存在最适提取温度。提取温度对玛咖芥子油苷提取率的影响如图2所示。随着温度的升高，芥子油苷提取率逐渐增加，当提取温度≥50℃时，提取率趋于稳定，维持在1.20%左右。由于常压下甲醇沸点为64.5℃，玛咖芥子油苷最适提取温度应选择在50℃左右。

图2 提取温度对玛咖芥子油苷提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the glucosinolate yield

2.2.2 提取时间对玛咖芥子油苷提取率的影响

提取时间也是影响天然产物功效物质分离提取的主要因素之一。适当增加提取时间会提高提取率，但会增加成本及能源消耗。提取时间对玛咖芥子油苷提取率的影响如图3所示。随着提取时间的增加，芥子油苷的提取率逐渐增加，但增速逐渐变缓。提取12h时芥子油苷提取率为0.986%;当提取时间达到24h后，芥子油苷提取率维持在相对恒定的水平，约为1.18%～1.22%。因此，芥子油苷适宜提取时间应选择在12～36 h。

图3 提取时间对玛咖芥子油苷提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the glucosinolate yield

2.2.3 料液比对玛咖芥子油苷提取率的影响

料液比对天然产物功效物质分离提取的影响较大，增加提取溶剂会提高提取率，但会带来后续溶剂回收成本过高等问题。料液比对玛咖芥子油苷提取率的影响如图4所示。随着料液比的增加，芥子油苷提取率逐渐增加。在料液比为1∶40(g∶mL)时，芥子油苷提取率为1.56%，继续增加料液比到1∶50，提取率增加到1.66%。综合考虑提取率和溶剂回收问题，芥子油苷最佳提取料液比应控制在1∶40左右。

图4 提取料液比对玛咖芥子油苷提取率的影响Fig.4 Effect of extraction solid-liquid ratio on the glucosinolate yield

2.3 正交试验优化

在单因素试验的基础上，以提取温度、时间和料液比为考察因素，设计3因素3水平正交试验 (表2)，对玛咖芥子油苷提取工艺进行优化，结果见表3。

表2 玛咖芥子油苷提取正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels for L9(34)orthogonal experiment design of glucosinolate extraction from maca

表3 玛咖芥子油苷提取正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment for glucosinolate extraction from maca

由表3极差分析结果可以看出，各因素对玛咖芥子油苷提取率的影响依次为:料液比(C)＞提取时间(B)＞提取温度(A)。最佳提取条件为A1B1C3，即温度 40℃，料液比 1∶50(g∶mL)，提取 12 h。经验证，在此条件下，玛咖中芥子油苷提取率为1.45%。艾中等［12］研究发现，国产玛咖中芥子油苷含量在0.65% ～1.83%，并且其含量在不同组织、不同产地间均有一定的差异。本研究最优条件下芥子油苷提取率与文献报道结果一致。

2.4 超声提取工艺优化

超声辅助提取是一种有效的天然产物提取工艺，具有提取率高，时间短等优点。本研究对超声波辅助提取云南栽培玛咖芥子油苷的工艺进行优化。预实验结果显示，超声条件下，室温下芥子油苷提取率较高;提取时间对芥子油苷提取率影响不大，在10～30 min内提取率无显著差异(数据未列出)。

超声辅助提取条件下料液比对芥子油苷提取率的影响见图5。随着料液比的增加，玛咖芥子油苷的提取率逐渐增加，当料液比为1∶50时，提取率最高可达1.66%，高于水浴浸提最优提取率(1.45%)。超声辅助提取工艺可缩短浸提时间，浸提温度降低有助于降低能耗。低温快速提取在提高效率的同时，还可最大限度地保持功效物质活性。

3 结论

本文对提取云南栽培玛咖中芥子油苷的不同溶剂进行了研究，结果显示甲醇溶剂提取率最高。正交试验结果显示，水浴浸提时各因素影响顺序依次为:料液比＞提取时间＞提取温度;最优提取工艺条件为:温度40 ℃，料液比1∶50(g∶mL)，提取 12 h，该条件下芥子油苷提取率为1.45%。超声辅助提取工艺优化结果显示，在室温条件下，料液比1∶50，超声辅助提取20 min，提取率1.66%。

图5 超声提取料液比对玛咖芥子油苷提取率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the glucosinolate yield under ultrasonic extraction

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