PCR-Targeting体系构建棒状链霉菌基因突变株

左志晗，郑津辉，赵海龙，李玉珊

(天津师范大学生命科学学院，天津市动植物抗性重点实验室，天津，300387)

棒状链霉菌可产生多种抗生素，如异青霉素N、去乙酰基先锋霉素C、头霉素C、克拉维酸和棒烷类衍生物等。其中，克拉维酸本身的抗菌活性很弱，但它具有强力广谱且不可逆的 β-内酰胺酶抑制活性［1］，使其成为临床上治疗耐药细菌性疾病的主要方法之一。但我国长期以来使用的克拉维酸复方制剂主要依靠进口产品，究其原因是我国目前没有好的适合于工业化生产的克拉维酸高产菌株，并且后期克拉维酸的分离提取工艺相对落后［2］。

由于克拉维酸的生物合成受到某些基因的级联调控，故某些调控基因的变化可能会使克拉维酸产量获得显著提高［3］，随着对克拉维酸生物合成途径研究的不断深入，采用基因工程的方法构建棒状链霉菌的克拉维酸高产突变株越来越受到各国学者的广泛关注。克拉维酸合成基因簇和头霉素C合成基因簇相邻，且受相同的调节蛋白CcaR的调控，研究表明，在发酵过程中降低或消除棒状链霉菌中头霉素C的合成能够提高克拉维酸的产量［4］，并可以有效减少发酵液中的干扰物质，简化提取工艺，对工业上克拉维酸的生产具有重要意义。

本课题组曾采用插入突变的方法成功构建了棒状链霉菌lat基因的突变菌株，结果突变株的克拉维酸产量较原始菌株提高了1.3倍［5］，本实验仍然从影响棒状链霉菌克拉维酸代谢的头霉素C的早期合成基因lat入手，采用PCR-Targeting体系对S.clavuligerus的lat基因进行了突变。PCR-Targeting是2002年由Gust和Kieser等人［6］创建的，用于突变链霉菌中的野生型基因。该体系中的λRED(gam，bet，exo)功能启动子能够极大地提高线性DNA的重组率，使得胞内重组酶BCD、外切核酸酶分解线状DNA，导致重组率低的问题得以解决。采用该体系最终构建得到了lat基因被敲除的无抗性标记的突变菌株S.clavuligerus lat::scar，其克拉维酸产量最高达到了出发菌株的2.83倍。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

菌株:克拉维酸产生菌棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585，由沈阳药科大学何建勇教授惠赠;大肠杆菌 E.coli DH5α 和 E.coli ET12567，E.coli BW25113/pIJ790均为本实验室保存菌种。

质粒:pIJ773，提供阿泊拉抗性模板质粒，在其抗性基因两侧包含转移复制起始点oriT以及FLP重组酶的识别位点 FRT序列，阿泊拉抗性(AprR);pGH112，大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒载体，带有氨苄抗性(AmpR)和硫链丝菌肽抗性(tsrR);pELA，lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重组质粒，带有氨苄(AmpR)、硫链丝菌肽(tsrR)和阿泊拉抗性(AprR)。

1.2 培养基

E.coli ET12567/pUZ8002，E.coli BW25113 以及E.coliDH5α所用为LB培养基［6］;棒状链霉菌所用产孢培养基为YMGA培养基［7］，种子培养采用TSB培养基，发酵培养采用SS培养基［8］。大肠杆菌－链霉菌接合培养基采用AS-1培养基(g/L)［9］。

培养基中抗生素的使用浓度如下:氨苄青霉素终浓度为 100 μg/mL，阿泊拉霉素为 25 μg/mL，卡那霉素为 50 μg/mL，氯霉素为 25 μg/mL，萘啶酮酸为 25 μg/mL。

1.3 常规分子操作

棒状链霉菌总DNA的提取、质粒向链霉菌的接合转移、链霉菌原生质体的制备及转化均按Kieser等人［8］的方法进行，大肠杆菌质粒DNA的提取、限制性内切酶消化、连接、PCR以及转化等操作均按Sambrook 等人［10］的方法进行。

1.4 引物设计及PCR

1.4.1 lat基因的 PCR 扩增

参照棒状链霉菌编码赖氨酸ε－转氨酶的lat基因相应的核苷酸序列，设计合成如下引物:

引物 1:5’-GAATTC CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCA-3’

引物 2:5’-GGATCC AGCGCGTCCTTCACAGCGGTGTACTCCCGCCCGTCGACG-3’

其中引物1和引物2中划线部分分别为EcoR I和BamH I酶切位点，以棒状链霉菌的基因组DNA为模板，引物1和引物2进行PCR扩增，退火温度n=61℃。

1.4.2 安普抗性框的PCR扩增

根据棒状链霉菌中lat基因的序列及质粒pIJ773中安普抗性基因的序列(该序列中还包含转移复制起始点oriT以及FLP重组酶的识别位点FRT序列，oriT便于后面重组质粒的接合转移)设计一对长59nt及58nt的引物(引物3和引物4)，其中引物3包含20nt的安普抗性基因上游的FRT序列以及lat基因上游的一段39nt的互补序列，引物4包含19nt的安普抗性基因下游的FRT序列以及lat基因下游的一段39nt的互补序列(图1.a)，两引物序列如下:

引物 3:5’-CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCACCCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-

3’;引物 4:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCGACCGCTCGTCACAGTGCGGCCAGCGGCTCTCGCAGACT-3’。

按此引物PCR所得产物中应包含一个安普抗性基因，并且在它的两端含有各带有39bp的lat基因上下游的同源序列，将此PCR产物称为安普抗性框。

以含有安普抗性基因的质粒pIJ773作为模板，引物3和引物4进行PCR扩增，退火温度n=50℃，进行安普抗性框的扩增。

1.5 PCR-targeting构建重组质粒

1.5.1 重组质粒pGH112-lat的构建

将PCR获得的lat基因片段经纯化及EcoR I和BamH I双酶切，与经同样双酶切的大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒载体pGH112连接，所得的连接产物用于转化 E.coli DH5α感受态细胞，得到重组质粒pGH112-lat(图1.b)。

1.5.2 重组质粒pELA的构建

将验证正确的重组质粒pGH112–lat电转至Ecoli BW25113/pIJ790感受态中，获得 E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子，将其制作成感受态细胞，将1.4.2中得到的带有lat基因同源序列的PCR产物安普抗性框电转化至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat感受态细胞中，将电转后菌株的培养温度由30℃提高到37℃，并在培养基中添加L-阿拉伯糖(终浓度为 10 mmol/L)。在 E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat的培养基中添加L-阿拉伯糖可诱导pIJ790中λRED的表达，在λRED功能启动子的作用下，安普抗性框迅速地与重组质粒pGH112-lat发生同源重组，即安普抗性框两端的lat同源序列与pGH112-lat所携带的lat基因发生同源双交换，从而使lat基因中插入了含有aac(3)iv基因的安普抗性框，得到了一个lat基因被插入突变的重组质粒pELA(图1.c)。由于pIJ790质粒中含有一个温敏型的复制起始子和氯霉素抗性基因，当电转后菌株的培养温度由30℃提高到37℃并且不再向培养基中添加Cml抗生素后，pIJ790质粒的复制子不再转录并且在没有抗生素的选择压力下，它便逐渐丧失了自我复制的能力。所以重组子中仅含有一种带有lat突变基因的重组质粒。

1.5.3 lat基因内部被敲除的重组质粒pSCAR的构建

将含有安普抗性框的重组质粒pELA(抗性框的两端含有FRT序列，该序列为FLP重组酶的识别位点)电转至 E.coliDH5α/BT340中，BT340为温敏型质粒，因此E.coliDH5α/BT340的感受态细胞的制备及培养过程温度均控制在较低的30℃。

在42℃高温诱导下质粒BT340可以表达FLP重组酶，FLP重组酶可以识别质粒pELA中安普抗性框两侧的FRT序列，将FRT之间的抗性基因敲除，在此过程中质粒BT340消失，之后原lat基因插入抗性基因的部分仅剩下81bp的scar序列(FRT序列经FLP酶切除后剩余的部分序列)，所得为lat基因内部被敲除的重组质粒pSCAR(图1.g)。

1.6 棒状链霉菌lat基因的突变

重组质粒pELA向棒状链霉菌的转移采用接合转移的方法［8］，即以 E.coli ET12567/pUZ8002/pELA 为供体菌株，将重组质粒转移至棒状链霉菌中。筛选安普霉素抗性菌株，28℃培养3～5 d，直至孢子出现，收集孢子，将孢子在不含抗生素的YMGA培养基上进行松弛培养，并在该培养基上传代3次，仍具有抗性的菌株初步确定为发生了双交换的菌株(图1.d，e)。

重组质粒pSCAR向棒状链霉菌的转移采用原生质体转化的方法［8］，以25%的PEG1000介导，再生培养基采用R2YE培养基，由于重组质粒pELA安普抗性框中的具有接合转移功能的oriT基因也同时被敲除，所以得到的重组质粒pSCAR为不具有接合转移功能的质粒(图1.g)，须通过原生质体转化的方法转入棒状链霉菌中。

转化子于30℃培养36h长出微小菌落后，用含8μg/mL硫链丝菌素(安普抗性框被敲除后采用重组质粒pSCAR所携带的硫链丝菌素抗性基因tsr进行筛选)的营养琼脂覆盖各转化平板，继续于30℃培养3 d。用无菌牙签挑取转化子于不含抗生素的YMGA平板，30℃培养3～4 d后，将长出的菌落分别于含有硫链丝菌素(Thio8)的营养琼脂平板及含有安普霉素(Apr25)的营养琼脂平板上影印妥当，对2种抗生素都敏感的菌落可初步断定为lat基因中抗性基因被敲除的突变菌株(图1.e～i)，PCR-Targeting构建棒状链霉菌突变株的流程见图1。

图1 PCR-Targeting突变lat基因的流程图Fig.1 Strategy of PCR-Targeting for lat mutation

1.7 发酵液中克拉维酸的HPLC分析

发酵液于10 000 r/min离心10 min，所得上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，按1∶5的比例与咪唑溶液混匀，30℃反应12 min后冷却到20℃，生成的衍生物采用Shim-pack VP-ODS(150×4.6)C18色谱柱进行HPLC 分析［11］。

2 结果

2.1 重组质粒的构建

将PCR获得的lat基因片段用EcoR I和BamH I双酶切，与经同样双酶切的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒载体 pGH112连接，转化 E.coli DH5α感受态细胞，得到重组质粒pGH112-lat。

将pGH112-lat及PCR获得的安普抗性框电转化至E.coli BW25113/pIJ790中，在 pIJ790中 λRED 的功能启动子的作用下，安普抗性框迅速地与重组质粒pGH112-lat发生同源重组，从而使lat基因中插入了安普抗性框，得到了一个lat基因被插入突变的重组质粒。以该重组质粒为模板，以引物3、引物4进行PCR验证，结果见图2。

图2 重组质粒pELA的PCR验证Fig.2 PCR verification of recombinant plasmid pELA

由图2可以看出，PCR产物大小在1.45kb处(图中箭头所指)，与安普抗性框大小相符。表明安普抗性框已成功整合到pGH112-lat的lat基因中，将该重组质粒命名为pELA。

将pELA电转至 E.coliDH5α/BT340中，BT340为温敏型质粒，在42℃高温诱导下质粒BT340可以表达FLP重组酶，FLP重组酶可以识别质粒pELA中安普抗性框两侧的FRT序列(图1.a)，将FRT之间的抗性基因敲除，原lat基因插入抗性基因的部分仅剩下81bp的scar序列(FRT序列经FLP酶切除后剩余的部分序列)，所得为lat基因内部被敲除的重组质粒 pSCAR(图 1.g)，其理论大小应为 6.98kb。对所得转化子进行提质粒及酶切验证，结果见图3，由图可知电泳结果与其理论值大小相吻合，所得lat基因内部被敲除的重组质粒命名为pSCAR。

2.2 棒状链霉菌基因突变株的验证

分别以棒状链霉菌出发菌株、lat基因中插入安普抗性框的突变株及抗性标记被敲除的突变株的基因组DNA作为模板，以lat基因上下游引物(引物1，引物2)进行PCR验证，结果见图4。由图4可知以抗性标记被敲除的突变株基因组为模板的PCR产物大小在400bp－500bp之间，与理论值481bp相一致(安普抗性框两侧的39bp距lat基因的上下游分别为230bp和170bp，以及81bp的scar序列)，而对照菌株基因组的PCR产物为1.8kb，以lat基因双交换突变株的基因组DNA作为模板的PCR产物为1.85kb(lat基因中的191～1 600bp被1.45kb的安普抗性基因所取代，因此PCR产物理论大小应为1.85kb)，证明lat基因中的抗性基因已经被敲除，所得的抗性标记被敲除的lat基因突变菌株，命名为S.clavuligerus lat::scar。

图3 重组质粒pSCAR的酶切验证Fig.3 Verification of recombinant plasmid pSCAR

图4 突变株的PCR验证Fig.4 PCR verification of the mutants

2.3 突变菌株克拉维酸产量的测定

对突变菌株lat::scar及出发菌株进行发酵培养，采用HPLC法对发酵120 h的发酵液进行克拉维酸含量的测定，结果见表1。

由表1可知，对同样的发酵液测定其克拉维酸的产量，结果突变菌株的克拉维酸产量最高可达166 mg/L，是出发菌株的2.83倍，表明采用PCR-Targeting的方法对lat基因进行敲除有效提高了棒状链霉菌的克拉维酸产量。

表1 突变菌株及原始菌株发酵液中克拉维酸产量的HPLC测定结果Table 1 HPLC analysis of clavulanic acid production of lat mutants and the original strain

3 结果讨论

本实验从影响棒状链霉菌克拉维酸代谢的头霉素C的早期合成基因lat入手，采用PCR-Targeting构建了棒状链霉菌的lat基因被敲除的无抗性标记的突变菌株 S.clavuligerus lat::scar。

采PCR-Targeting构建的重组质粒由于具有接合转移功能，易于转入棒状链霉菌中，并且由于插入到突变的目标基因中的选择标记抗性框两端带有FRT序列，可通过FLP重组酶的识别作用方便的将最终所得的棒状链霉菌工程菌株中的抗性基因敲除，得到无抗性的lat基因敲除的突变菌株，所得的不同突变株的克拉维酸产量是原始出发菌株的1.82～2.83倍。由于最终所得突变株无抗性标记，因此可以重复的将该方法应用于突变棒状链霉菌的其他基因，实现用一种抗性标记突变同一菌株不同基因的目的，从而使突变同一菌株的多条基因时需要多种选择性标记的问题得以解决，为链霉菌的基因工程方法改造提供了又一种可行的方法。

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