有氧运动对衰老大鼠心肌保护作用的机制研究

黄 伟

(郑州大学体育学院，河南郑州 450044)

心肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)由胶原、糖蛋白和蛋白聚糖构成，其中胶原含量最为丰富(主要是I型和III型胶原)，其功能主要是:为肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞提供支持，传导肌细胞内外的机械应力，保证心肌的弹性和顺应性，介导信号转导通路［1］。伴随着衰老的进程，心肌ECM过度沉积导致心肌纤维化，即机械性重塑和结构性重塑，主要表现为室壁张力增加、弹性下降、心脏充盈期缩短，心脏负荷增大造成心肌肥大而虚弱、心脏功能进行性下降，射血分数减少并易于发生心律失常和心衰［2］。据报道，衰老时I型胶原含量增加2～3倍，主要与胶原降解减少、合成增加以及成纤维细胞增殖有关［2］。

胶原降解和组织重塑是由一类锌离子依赖的内肽酶家族——基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)催化介导的。迄今为止发现20多种MMPs，心肌主要表达 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 和MMP-14［3］。MMPs 以无活性的前体(酶原)(Pro-MMPs)形式由心肌细胞分泌，活化后转变为MMPs(active MMPs，本文中的MMPs即指活性MMPs)，降解胶原，从而破坏ECM［3］。MMPs活性主要由内源性的组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)调节［3］。已有的研究表明，MMPs和 TIMPs功能失调是各种生理病理过程中(衰老、心衰等)心肌重塑的重要原因［4-5］。心衰时TIMPs显著增高，与上游的调控信号转化生长因子 -β(transforming growth factor-β，TGF-β)和氧化应激有关［6］。

体力活动减少可使心搏出量和心输出量下降，患心脏病的风险增加，加速心脏衰老(cardiac aging)。规律活动特别是有氧运动可通过增加搏出量和心输出量而有效改善各年龄人群的心功能［7］。此外，有研究显示［8］，运动可减少由于增龄造成的心脏胶原积累并与心功能改善有关联，但具体的分子机理尚不清楚。本研究以衰老大鼠为实验模型，利用10周跑台运动，目的在于:1)利用病理组织学方法观察衰老大鼠规律运动后心肌胶原纤维的形态学变化;2)利用分子生物学的方法探讨TGF-β/TIMP-1/MMPs信号通路是否参与了运动对衰老大鼠心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与取材

本研究于2010年4月购进3月龄健康雄性SPF级SD大鼠(购自河南大学医学院实验动物中心)30只后，随即选取10只为青年对照组(young control group，YC组)，饲养3天后，称量体重，用戊巴比妥钠120 mg/kg麻醉大鼠测定血流动力学参数，然后取出心脏，迅速转入液氮中并于﹣80℃低温冰箱冻存待测。其余20只饲养至2012年1月(20月龄)制作衰老动物模型，将其随机分为衰老对照组(old control group，OC组，n=10)和衰老运动组(old exercise group，OE组，n=10)。OE组进行10周跑台运动，运动方案如下:1周适应性跑台运动(坡度:0°，速度:5m/min，时间:10 min/天)后进行9周正式运动(坡度:12°，速度:10.5 m/min，时间:45 min/天，频率:5 次/周);OC组处于安静状态10周。末次实验48 h后麻醉大鼠测定血流动力学参数并取出心脏冻存待测。本实验在河南省体育科学研究所重点实验室完成。

1.2 血流动力学参数测定

PE-50心导管于右侧颈总动脉逆行插管至左心室，另一端接压力换能器输入多媒体生物信号采集、处理系统，记录左心室收缩期压力(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室压力最大上升速率(maximaldevelopingrateofleftventricular pressure，+dp/dtmax)和左室压力最大下降速率(maximal descending rate of left ventricular pressure，-dp/dtmax)。

1.3 心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)测定

取心脏组织切片，40 g/多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，行Masson染色法使心肌细胞染成红色，胶原染成绿色。每张切片随机选取5个视野，用图像分析软件测量胶原组织所占百分率(心肌胶原面积/所测视野面积)，取平均值即为CVF。

1.4 心肌I、III型胶原mRNA表达测定

心肌组织匀浆后，用Trizol法抽提总RNA，经逆转录反应获得cDNA，实时荧光定量 PCR(美国产 ABI 7500型荧光定量 PCR仪)测定心肌 I、III型胶原mRNA含量，引物参照文献［9］，内参基因 GAPDH。引物序列分别为，I型胶原(1075bp):上游 5'-CAAGAATGGCGACCGTGGTGA-3'，下 游 5'-GGTGTGACTCGTGCAGCCAT-3';III型胶原(450bp):上游5'-AGATGGACTAAGTGGACATC-3';下游5'-CATGTTTCTCCGGTTTCCAT-3';GAPDH(308bp):上游 5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，下游 5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。扩增条件:预变性94℃ /5 min;94℃ /45 s，56℃ /45 s，72℃ /1 min，共 32个循环，终末延伸72℃/10 min。计算相对表达量=2-△Ct，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

1.5 心肌蛋白表达测定

心肌组织裂解后提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法对蛋白定量。灌制10%的分离胶和5%的浓缩胶，恒压120 V、80 mA预电泳10 min，上样，进行SDS-PAGE电泳，转膜。1:1000 兔抗大鼠一抗(Pro-MMP-1、2、3、9、14，MMP-1、2、3、9、14，TGF- β 和 TIMP-1)4℃孵育过夜，TBST洗涤PVDF膜，1:1000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗室温孵育1 h，暗室中滴加发光底物混合物2 mL于PVDF膜上，曝光、显影、定影。对目的蛋白进行光密度分析，以GAPDH为内参。目的蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.6 数据处理

实验数据用均值±标准差表示，使用SPSS统计软件(SPSS 14.0 for Windows)进行数据统计处理，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。显著性水平取α=0.05和α=0.01。

2 结果

2.1 血流动力学参数

表1结果显示，与YC组比较，OC组LVSP、±dp/dtmax显著性下降(均为P＜0.01)，LVEDP则显著性升高(P＜0.01);与 OC组比较，OE组 LVSP、±dp/dtmax显著性升高(均为P＜0.01)，LVEDP则显著性下降(P＜0.01)。

表1 各组大鼠血流动力学参数比较

2.2 心肌Masson染色与CVF

Masson染色显示，胶原纤维呈蓝色，心肌纤维呈红色。YC组心肌细胞着色均匀，无明显胶原成分;OC组心肌细胞减少，纤维化程度明显，CVF显著高于YC组(P＜0.01);OE组较OC组心肌细胞增多，胶原纤维(即CVF)显著减少(P＜0.01)。见图1。

图1 各组心肌Masson染色与CVF比较注:与YC组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与OC组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 心肌I、III型胶原mRNA表达

图2 各组心肌I、III型胶原mRNA表达的变化注:与YC组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与 OC组比较，#P ＜0.05，##P＜0.01。

图2结果显示，与YC组比较，OC组I、III型胶原mRNA均升高(均为P＜0.01);与OC组比较，OE组I、III型胶原 mRNA则降低(分别为 P＜0.01和P ＜0.05)。

2.4 心肌Pro-MMPs、MMPs蛋白表达

与 YC 组比较，OC 组Pro-MMP-2、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14降低(均为 P ＜0.01)，Pro-MMP-3、TGF-β 和TIMP-1升高(均为P ＜0.01);与OC组比较，OE组Pro-MMP-2和Pro-MMP-3升高(均为 P ＜ 0.01)，Pro-MMP-14、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-14、TGF-β 和 TIMP-1降低(均为 P＜0.01);Pro-MMP-9和MMP-9在各组均无显著性差异(均为P＞0.01)。见图3～图8。

图3 各组心肌Pro-MMP-1和MMP-1蛋白表达的变化注:与YC组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与OC组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

图4 各组心肌Pro-MMP-2和MMP-2蛋白表达的变化注:与YC组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与OC组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

图5 各组心肌Pro-MMP-3和MMP-3蛋白表达的变化注:与YC组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与OC组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

图6 各组心肌Pro-MMP-9和MMP-9蛋白表达的变化

图7 各组心肌Pro-MMP-14和MMP-14蛋白表达的变化注:与YC组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与OC组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

图8 各组心肌TGF-β和TIMP-1蛋白表达的变化注:与YC组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与OC组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 讨论

本研究发现，10周跑台运动使衰老大鼠心脏I型和III型胶原表达下调、CVF下降，MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14表达上调以及TIMP-1表达下调，心功能得到逆转。此外，本研究还观察到，正性调控TIMP-1的上游信号分子——TGF-β在衰老时显著上调，而运动则使其表达下降。上述结果验证了我们的假设，即规律运动训练可延缓心脏衰老过程中的胶原沉积和心肌纤维化并改善心功能，其机制与TGF-β/TIMP-1信号通路受到抑制，MMPs表达上调有关。

3.1 运动对衰老心脏的保护作用

本研究成功建立衰老大鼠心肌纤维化模型，即与YC组比较，OC组I型和III型胶原mRNA显著升高，心肌Masson显示CVF升高，血流动力学测定发现LVSP、±dp/dtmax显著性下降，LVEDP则显著性升高，说明机体衰老的过程中，心脏胶原合成增加，心肌逐渐出现纤维化［10］，心室顺应性下降伴心脏舒缩功能障碍，最终导致心力衰竭的发生。

阻遏及逆转心肌纤维化已成为防治恶性心血管病事件发生的重要环节。学者们尝试多种方法改善心肌纤维化，例如药物疗法(血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、中药复方CFX等)［11］、干细胞技术［12］均可抑制心室重塑，但药物存在各种副作用，而干细胞技术尚处于实验阶段。近年来，运动康复疗法在防治心血管疾病中的作用逐渐引起关注，规律活动可有效改善各年龄人群的心功能，而对于心脏病患者，有氧运动则可减轻其临床症状，提高生活质量，降低死亡率和住院率［7］。相比其他手段，运动疗法具有经济、实用、副作用小、易于实施等特点。有研究显示，运动对心功能的改善作用可能与抑制心脏胶原积累有关［8，13］。Woodiwiss等［14］的研究发现，青年大鼠 16 周经过随意滚轮运动，心脏僵硬度降低，而胶原含量则无显著性变化，提示运动对健康心脏胶原含量影响不大。Choi等［8］报道，长期运动降低了衰老大鼠心脏胶原交联(collagen cross-linking)并改善心脏舒张功能障碍。本研究发现，与OC组比较，OE组I型和III型胶原mRNA表达下调，CVF下降，虽然血流动力学参数尚未恢复至 YC组水平，但与 OC组比较，LVEDP降低，LVSP、±dp/dtmax升高。上述结果提示，10周跑台运动通过抑制衰老大鼠心肌胶原合成，延缓甚至逆转了由于衰老造成心肌纤维化和心功能下降，同时也证实了临床运动康复疗法的积极效果。一项随访研究证实［15］，优秀运动员在70岁时仍能保持较高的心血管功能，因此，规律运动能够延缓增龄过程中发生的心脏机械性和结构性重塑，对于心功能具有保护效应。

3.2 TGF-β/TIMP-1/MMPs信号通路参与了运动对衰老大鼠心肌的保护作用

心肌MMPs介导心脏胶原蛋白降解，但MMPs调节异常则可造成心肌纤维化、心脏衰老甚至心力衰竭［16］。TIMP-1作为MMPs的内源性抑制剂，能够与活化的MMPs 1:1结合形成酶-抑制剂复合物，从而抑制MMPs的蛋白水解活性［16］。研究指出，缺血-再灌注损伤［17］和心梗［18］可同时上调心肌MMPs和TIMP-1表达，而本研究中与YC组比较，OC组虽然Pro-MMPs变化各异(Pro-MMP-3升高，Pro-MMP-2下降，Pro-MMP-1、9、14则无显著性变化)，但具有活性的MMPs表达均下降而TIMP-1则升高。这一矛盾结果说明自然衰老与疾病造成的心脏异常存在不同的调节机制，增龄过程中MMPs活性逐渐降低，胶原降解减少，ECM的更替(turnover)速率加快，胶原逐渐沉积甚至出现纤维化;而心脏疾患则造成MMPs升高，可能与心脏瘢痕组织形成有关［18］。

本研究利用10周跑台运动干预发现，与OC组比较，OE 组 MMP-1、MMP-2、MMP-3和 MMP-14表达均显著升高，提示运动逆转了增龄造成的MMPs下调表达，促进胶原降解，这可能是运动对抗衰老造成的心肌胶原沉积和心肌纤维化并对衰老心脏起保护作用(心功能改善)的机制之一。运动对MMPs的作用与TIMP-1有关，衰老时TIMP-1升高从而抑制了MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14的表达量，而运动则通过下调TIMP-1部分解除了对MMPs的抑制作用，提示TIMP-1/MMPs可能是运动防治心脏衰老的干预靶点。

研究发现，TGF-β与心血管疾病密切相关，心肌特异性表达TGF-β可导致心肌肥厚和心肌纤维化。血管紧张素II、内皮素等引起心肌纤维化的信号分子均可导致TGF-β增加，因此TGF-β上调成为诸多因素所致心肌纤维化的共同通路［19］。Brooks等［20］发现，24月龄TGF-β杂合子小鼠心肌纤维化程度较野生型明显减轻，生存率和心功能得到改善。药理研究表明［21］，降低TGF-β表达则可减弱心肌胶原合成，对于心肌纤维化具有潜在应用价值。已证实，TIMP-1是TGF-β下游的效应分子，增龄可升高TGF-β表达量［19］(与本研究结果一致，即TGF-β在OC组显著高于YC组)，TGF-β通过上调TIMP-1表达参与了心脏衰老过程。运动对衰老过程中心脏TGF-β/TIMP-1信号通路的影响尚无报道，本研究发现，与OC组比较，OE组TGF-β表达量显著下调，结合上述结果，我们推测，规律运动通过抑制TGF-β/TIMP-1上调MMPs表达，因此，TGF-β/TIMP-1/MMPs信号通路参与了运动对衰老大鼠心肌的保护作用。

4 结论

衰老过程中，心脏胶原合成增加、降解减少，胶原含量增多，进而造成心肌纤维化和心功能下降;规律运动训练抑制胶原合成并促进胶原降解，延缓心脏衰老过程中的胶原沉积和心肌纤维化并改善心功能，其机制与TGF-β/TIMP-1信号通路受到抑制，MMPs表达上调有关。

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