发酵法制备富马酸的关键技术及其进展

李 霜，徐 晴，黄 和

(南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211800)

富马酸是一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为优先发展的12种平台化合物之一［1］，可作为有机化工原料和精细化工产品被广泛应用于材料(树脂、涂料及增塑剂等)、医药、化工、食品及饲料添加剂等领域［2－3］。富马酸口味纯正，酸度是柠檬酸的1.5倍，不仅没有毒副作用，而且对抑菌、防腐有显著功效，成为近年来兴起的一种新型食品调味剂。2010年卫生部批准了富马酸一钠作为食品添加剂使用［4］。富马酸经酶法转化可制备L-苹果酸和L-天冬氨酸，前者是世界排名第三的食品酸味剂，成为目前最有发展前景的有机酸之一［5］;后者可用于各种食品饮料添加剂、有机合成中间体及生化试剂等。

当前富马酸产业主要以苯为出发原料，采用顺酐异构化工艺路线，我国产能已逾10万t规模;近年来化石资源价格攀升，食品级富马酸价格已接近10 000元/t。随着人们对食品、医药领域产品“天然、营养”关注度的提升，以天然可再生资源为原料，利用微生物发酵法制备富马酸，不仅有助于实现资源替代，更为富马酸产业的发展和提升提供了技术支撑。

根霉属被认为是最佳的富马酸生产菌。利用根霉菌发酵法制备富马酸的研究已逾半个世纪，主要有以下几个技术难点阻碍了产业化进程:①根霉菌缺乏遗传操作工具，菌株定向改造难度大;②根霉菌形态发育机制不明，发酵过程控制难;③富马酸及其主要衍生物L -苹果酸、L -天冬氨酸的生产缺乏系统集成、工艺繁琐、成本高。笔者针对生物法制备富马酸的技术现状进行总结，从优良菌株的选育和发酵过程控制等角度对制约生物基富马酸的关键工程技术进行阐述。

1 根霉菌发酵生产富马酸代谢机制

1985年，Osmani等［6］提出了根霉菌产富马酸的“胞液途径”学说，成为目前的主流观点。他们认为少根根霉的胞液中存在一条完整的“TCA还原途径”，丙酮酸羧化酶是该途径关键酶之一，它催化固定化CO2与丙酮酸反应生成草酰乙酸，草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下生成苹果酸，苹果酸再在富马酸酶的作用下生成富马酸(图1)。该途径是富马酸的主要途径，其中丙酮酸羧化酶的作用更为重要，它起着固定CO2的作用，这也是实际生产中富马酸对葡萄糖的摩尔转化率远高于100%的根本原因;而线粒体内TCA循环途径的主要作用是提供能量(ATP)、还原力(NADH)和中间代谢产物以供菌体生长。

Kenealy等［7-8］通过生理生化研究，从不同方面证实了Osmani等的观点，即胞液中的TCA还原途径才是根霉菌积累富马酸的主要途径。1996年，Wright等［9］通过14C同位素标记的方法构建了 R.oryzae的葡萄糖代谢模型，证明了胞内存在2个独立控制的丙酮酸代谢池，一个存在于胞液中，用于合成乙醇、乳酸、草酰乙酸、苹果酸及富马酸等，另一个主要用于TCA循环(图1)。高产富马酸的根霉菌除了能生产富马酸外，还能产生其他低浓度的羧酸，如苹果酸、乳酸和柠檬酸等，某些条件下还可能会积累乙醇。乙醇、乳酸与富马酸的合成途径，甚至包括TCA循环，它们之间在丙酮酸的分配利用上是一种竞争关系(图1)。同时TCA循环又为乙醇、乳酸及富马酸的合成提供能量及还原力，因此它们之间又是一种共存关系。这是一种矛盾共存体，需要在2个丙酮酸代谢池之间寻求一种碳流分配的平衡，从而实现目标产物积累的最优化。

图1 米根霉积累富马酸及其副产物的主要代谢途径Fig.1 Metabolic pathway of fumaric acid and byproducts in Rhizopus oryzae

富马酸的胞液合成途径成为近年来的重要生理研究方向。Song等［10］采用RT-PCR扩增得到了富马酸酶基因(fumR)，酶学性质表征结果表明该酶为富马酸积累时期的胞液富马酸酶，主要催化L-苹果酸向富马酸的转化反应。此后，Ding等［11］进一步研究了碳氮比对胞液富马酸酶活力及富马酸积累的影响，结果表明N源限制对该酶活力影响显著，且与富马酸积累成正相关。上述研究表明胞液途径是富马酸积累的主要途径，该途径的强弱与限氮营养条件有关。鉴于富马酸酶在胞液途径中的重要作用，Zhang等［12］将fumR基因在米根霉进行了过表达研究，结果表明单一强化富马酸酶活性并不能提高富马酸产量，由于富马酸酶同时能将富马酸转化为L -苹果酸，导致L-苹果酸产量有所提高。

2 富马酸生产菌种的选育及构建

2.1 高效积累富马酸的根霉菌选育

由于根霉菌缺乏定向基因操作的工具元件，因此采用诱变育种方法提高富马酸产量成为高产菌株的主要选育手段。徐文雯等［13－14］均对高效筛选方法做了有益探索，设计了溴甲酚绿加塑料小管的平板菌种初筛策略，建立了适合于产酸丝状真菌诱变选育的变色圈平板初筛法，大大降低了诱变育种后高产菌株选育的工作量。徐文雯等［13］以少根根霉为出发菌株，通过UV和LiCl诱变，获得了摇瓶发酵富马酸产量达55 g/L的高产菌株;臧茹［14］以米根霉为出发菌株，采用UV反复诱变方式，获得的高产菌株在5 L罐发酵产量达41 g/L。米根霉在积累富马酸时，主要代谢副产物为乙醇;因此，削弱乙醇代谢途径成为一种改造策略。Fu等［15］以丙烯醇为筛选压力，筛选了乙醇途径中关键酶醇脱氢酶(ADH)活力降低的菌株，乙醇积累量降低83.7%，富马酸产量增加21%，摇瓶发酵达52.7 g/L。

2.2 利用基因工程手段构建富马酸生产菌

以丁二酸为代表的利用基因工程手段构建有机酸生产菌株已经获得了长足的发展，目前重组大肠杆菌生产丁二酸的发酵水平已逾100 g/L［16］。相比而言，利用基因工程手段构建的富马酸生产菌株仍处于很低的积累水平。

Kaclíková 等［17］构建了缺失线粒体富马酸酶酿酒酵母工程菌用来积累富马酸，以葡萄糖为底物时，最高富马酸积累量不到0.5 g/L。此前的代谢途径研究中，由于丙酮酸羧化酶对于富马酸积累具有重要影响，因此，吴世根等［18］构建了过表达丙酮酸羧化酶的Pichia pastoris，结果表明富马酸合成途径的碳流分配得到提升，草酰乙酸和L -苹果酸的积累都得到了显著增加，而富马酸的积累仅从38.71 mg/L增加到40.05 mg/L。Xu等［19］以酿酒酵母为表达宿主，通过过表达来自米根霉的富马酸酶基因和苹果酸脱氢酶基因以及酿酒酵母自身的丙酮酸羧化酶基因，重构了富马酸合成途径，富马酸的积累量仅为3.18 g/L。据推测，导致重组菌富马酸产量低的一个重要原因可能在于宿主细胞如E.coli或酵母中缺乏富马酸转运系统，导致富马酸难以被分泌至胞外。上述研究表明，采用基因工程手段构建的产富马酸重组菌株，在技术经济性上还难以与根霉菌竞争。

3 利用淀粉质原料发酵制备富马酸

现有柠檬酸、乳酸等大宗有机酸发酵产业均以淀粉基原料如玉米粉、木薯粉、淀粉等来进行工业化生产。以玉米淀粉为例，相比葡萄糖的价格，每吨原料的成本便宜800～1 000元，有助于进一步降低原料成本。在已报道的富马酸发酵工艺中，仍以葡萄糖为主要原料，表明相关研究离富马酸的产业化尚有距离［20］。淀粉基原料相比糖蜜、果汁等原料，来源广泛且价格相对平稳，更具备工业可操作性。

3.1 原料的选择

在根霉菌发酵积累富马酸的发酵工艺研究中，发酵培养基的碳氮比成为研究根霉菌生产富马酸过程的考察重点，高碳氮比是实现高转化率的前提。Zhou等［21－22］在利用根霉菌生产富马酸的发酵培养基中不添加N源，也获得了不错的发酵结果。Moresi等［23－24］在 R.arrhizus发酵产富马酸过程中尝试使用包括马铃薯淀粉、玉米淀粉及木薯淀粉在内的不同来源的淀粉水解液，并对淀粉水解工艺进行了优化，利用土豆淀粉的产酸速率可达0.35 g/(L·h)。除纯淀粉原料外，其余粗淀粉基原料如全玉米粉、脱胚玉米粉、木薯粉等均因为含有一定的氮组分，对产酸发酵过程具有显著影响。丁月月［25］考察了淀粉、全玉米粉、脱胚玉米粉和木薯粉4大类淀粉原料的含氮量及其对富马酸发酵的影响，结果表明淀粉是最适原料，而其余粗原料中，脱胚玉米粉由于含氮量相对较低，成为最适粗原料。

3.2 工艺优化

以淀粉基为原料时，涉及原料预处理工艺，如淀粉原料的糊化、液化以及糖化等工艺，将预处理工艺与发酵结合起来，又可分为分步水解发酵(SHF)和同步糖化发酵(SSF)等工艺。其中，同步糖化发酵工艺不仅省去了淀粉质原料酸解或酶解的过程，节约设备投资，降低了过程成本，而且糖化产生的底物可直接为菌体利用，减少单糖或双糖的积累，减轻糖化过程的抑制作用，增加水解速率，有利于维持较高的生产强度，缩短发酵周期。因此，同步糖化发酵是高底物浓度在小反应体积下进行低成本生产的最佳方式。

在乳酸发酵研究中，对粗淀粉基原料的各种水解工艺与发酵工艺开展了较为全面的研究，为乳酸的高效制备奠定了基础［26］。成熟的柠檬酸发酵工业中，一直利用黑曲霉自产的糖化酶进行同步糖化发酵工艺。富马酸生产菌株米根霉，具有一定的糖化酶活力，但完全利用自身的糖化酶尚不足以完成同步糖化发酵过程。笔者所在课题组对利用淀粉基原料制备富马酸开展了系列研究［25，27］，对同步糖化发酵制备富马酸的过程进行了优化，通过添加少量糖化酶(终用量3.4 U/L)即可实现同步糖化发酵过程;以脱胚玉米粉为C源时，富马酸产量达35.5 g/L。通过诱变育种方式获得糖化酶活力提高的米根霉菌株，突变株糖化酶体积活力由7.2 U/mL提高至18.6 U/mL，利用自产糖化酶以淀粉为原料同步糖化发酵时，富马酸产量达44 g/L［28］。同步糖化工艺制备富马酸的相关研究，为利用柠檬酸发酵产业的装置生产富马酸提供了技术支撑，有助于产业推广。

4 利用纤维质原料发酵制备富马酸

木质纤维素资源极为丰富，以木质纤维素资源作为生物发酵原料时，需要通过预处理技术如酸水解、碱水解和酶解等手段将原料水解产生木糖、葡萄糖等可发酵性糖，再经过微生物转化成目标产物。木质纤维素中的木糖占总质量组分的25%～40%，其生物可利用度较差，阻碍了木质纤维素的高效利用，影响了经济性。

目前，利用木质纤维素产化学品的研究主要集中在乙醇，但乙醇对糖的转化率较低，葡萄糖转化为乙醇的理论转化率仅51%，而对L -乳酸的理论转化率约100%，对富马酸的理论转化率达129%，故用木质纤维素生产有机酸理论上较乙醇具有更高的原料利用。Mass等［29］指出利用木质纤维素生产有机酸等大宗化学品是未来的主要发展方向。

Kautola等［30］利用木糖为原料，采用固定化少根根霉发酵10.25 d后得到富马酸最大产量为16.4 g/L，获得的最高体积生产率仅为0.087 g/(L·h)。Woiciechowski等［31］以蒸爆法处理木料后，水解液用于米根霉发酵产富马酸，富马酸产量为5.085 g/L。Liao等［32］以牛粪为原料，利用米根霉发酵富马酸联产几丁质，发酵4 d后富马酸转化率达31%，生物量为11.5 g/L，其中几丁质产率为0.21 g/g生物质。以木质纤维素、粪肥等生物质资源作为发酵培养基的C源，虽然原料来源廉价且丰富，但富马酸产量低，生产速率差，制约了其应用前景。

根霉菌具有天然的木糖代谢途径，以木糖为唯一C源时，能利用木糖进行生长代谢。同样，根霉菌也存在“碳代谢阻遏效应”，木糖葡萄糖共存的条件下会优先利用葡萄糖。笔者所在课题组对根霉菌利用木糖和葡萄糖的代谢特征进行了分析，结果表明:以木糖为C源时，代谢反应趋向于合成反应，细胞总蛋白质、总脂肪以及总糖等组分较高，几乎不积累有机酸;以葡萄糖为C源时，代谢反应趋向于有机酸、乙醇的积累［33］。这一代谢特征显示，采用分步利用木糖和葡萄糖的技术路线［34］，以木糖为根霉菌种子培养的C源和以葡萄糖为产酸发酵的C源有助于实现对木质纤维素资源的全利用。Xu等［35］以玉米秸秆为原料，利用稀酸水解半纤维素组分获得的木糖进行根霉菌的种子培养，酶解纤维素组分获得的葡萄糖进行产酸发酵，葡萄糖质量浓度为80 g/L时，富马酸产率、生产强度最大，分别为0.35 g/g和0.33 g/(L·h)，富马酸产量达到27.79 g/L，达到了根霉菌利用木质纤维素发酵制备富马酸的最高转化率。此后，Tai等［36］进一步研究了半纤维素水解液中甲酸、乙酸和糠醛等抑制物组分对根霉菌生长及代谢的影响，结果表明上述抑制物组分在一定浓度范围内对米根霉的生物量和菌体细胞壁壳聚糖组分具有促进作用，分别达24.5% ～37.8%和60.1% ～207.1%，最大时增长量可达2倍之多。这一结果表明根霉菌可利用木质纤维素原料生产富马酸，还可以通过联产壳聚糖来解决木糖的高效利用。

5 非钙盐中和工艺的开发

传统的富马酸发酵过程需要添加CaCO3作为中和剂，维持发酵液pH4.5～5.5。35℃时，富马酸钙的溶解度约是2.5%，随着发酵过程的进行，发酵液中的固态部分，包括菌体、CaCO3、富马酸钙等，逐渐转变成固态凝胶状，由于富马酸逐渐释放到胞外，在细胞表面与CaCO3接触后生成的富马酸钙会逐渐包裹住细胞，抑制细胞对营养物质的吸收及传质传氧;发酵结束后，需要添加H2SO4来中和过量的CaCO3并回收产物，从而产生大量的废渣(CaSO4)和废水，环保压力较大。因此，替换钙盐工艺成为一种趋势。

5.1 替换中和剂

Zhou等［37］对中和剂包括 NaHCO3、Na2CO3、Ca(OH)2、(NH4)2CO3以及 KOH与 K2CO3的混合物等均做了考察，希望在维持或达到更高富马酸生产效率的同时获得更高溶解度的富马酸盐，更有利于下游的富马酸分离提取工艺，并减少能耗。例如，分别以钠盐和铵盐为中和剂时，如果将富马酸发酵与下游的L-苹果酸和L-天冬氨酸转化工艺相结合，就可以通过直接浓缩发酵液中的富马酸钠或富马酸铵为原料，从而减少工艺步骤。但采用这些中和剂时，富马酸产率较低，其中使用Ca(OH)2时的富马酸产量和生产强度分别只有原来的32.3%和25.2%。造成这种差距的原因可能是使用CaCO3做中和试剂时，它与富马酸反应能产生更多可溶性的CO2，从而促进了丙酮酸羧化反应，这与前面分析过的富马酸合成机制是一致的。用Na2CO3或NaHCO3做中和试剂时，富马酸的产量和生产强度同样比用CaCO3要低，可能原因有:①Na+对细胞代谢机制产生了影响;②富马酸钠盐的溶解度比富马酸钙高，对发酵过程产生了一定的产物反馈抑制作用。更换中和剂导致富马酸产量、转化率以及生产速率降低，使得相关工艺缺乏技术经济性。

5.2 反应分离耦合技术

开发一种不需要使用中和试剂、同时能避免产物抑制的高产率工艺，将显著改善整个富马酸发酵工艺的经济性，采用发酵分离耦合技术(又称原位分离技术，ISPR)可能是解决该问题的有效途径。

Roa Engel［38］研究了发酵与冷却结晶工艺整合制备富马酸的技术，以NaOH为中和剂，同时通入10%左右的CO2，控制发酵体系pH相对较低(pH 3.5)，发酵罐中富马酸质量浓度可达20 g/L左右，经过滤，菌体的发酵液进入冷却结晶罐(0～5℃)，部分富马酸被结晶析出(4～5 g/L)。显然，该策略的顺利实施尚有难度。进一步通过模拟计算，总结出发酵与冷却结晶工艺整合技术的瓶颈在于能否采用更低的发酵pH(如pH3.0)，因此，提升根霉菌对高酸性发酵环境的耐受性成为该工艺实施的前提。

Cao等［39］采用生物被膜转盘反应器固定化米根霉细胞，以树脂Amberlite IRA -900为分离载体，同步发酵-吸附分离制备富马酸，获得了最高的富马酸转化率和生产速率，在20 h内能将100 g/L葡萄糖发酵生成富马酸85 g/L，生产速率高达4.25 g/(L·h)。树脂Amberlite IRA -900吸附的富马酸可用NaCl洗脱，由于富马酸溶解度较低(25℃，低于5 g/L)，洗脱液用盐酸酸化后即可得到纯度近乎100%的富马酸晶体。该系统的主要特色在于生物被膜转盘反应器，固定于转盘上的米根霉细胞能维持活力达两周，但该系统难以实现工业化生产。

针对转盘反应器的缺点，笔者所在课题组开展了搅拌式反应器发酵与离子交换树脂分离耦合制备富马酸的研究［40］。通过对自固定化米根霉在搅拌式反应器中的菌球形态控制的研究［41］，以及基于耦合体系的离子交换树脂分离工艺的优化［42］，富马酸产量、糖酸转化率和富马酸生产强度分别达到了58.6 g/L、76.4%和1.72 g/(L·h)。以 NaOH 洗脱树脂，富马酸的洗脱浓度仍较低;富马酸的结晶还需增加酸化工艺，且将洗脱收集的富马酸钠用于L-苹果酸的转化反应时，还需进一步浓缩。

针对树脂洗脱液中富马酸盐浓度低的问题，笔者所在课题组进一步开发了络合萃取与发酵过程耦合生产富马酸的工艺［43］，在搅拌反应器中培养根霉菌，发酵液过滤去除菌体后泵入逆流萃取塔，萃取剂为叔胺、季铵混合物，萃余液经两级溶剂捕集去除细胞毒性后返回发酵罐，发酵罐的pH调控由萃取发酵自动调节，发酵周期 60 h，糖转化率50.8%，生产速率为1.0～1.1 g/(L·h)。反萃后富马酸铵或富马酸钠质量浓度达150 g/L，可作为底物用于L-天冬氨酸或L-苹果酸的酶法转化。该体系与树脂耦合体系相比，最大优势在于萃取过程具有浓缩富集作用，大幅降低了工艺能耗，促进了富马酸与下游衍生物的技术集成。

6 展望

随着食品、医药等高端应用市场对高品质、纯天然原料需求的增加，利用生物法生产富马酸因其工艺简单、过程可控，产品天然无毒，安全性及品质得到保障，市场前景广阔。因此，加大生物法制备富马酸的工程技术研究，选育优良菌株并优化生产工艺，提高转化率和生产速率，完善富马酸及其衍生物如L-苹果酸、L-天冬氨酸的技术集成，进一步降低生物基富马酸的制造成本，将大幅推动市场发展。

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