生物制造手性化学品的现状及其发展趋势

吴坚平，杨立荣

(浙江大学 化学工程与生物工程学系，杭州 310027)

由于日益严重的资源、能源和环境压力，人类社会的可持续发展面临前所未有的挑战，促使传统的化工、制药、食品、材料等工业制造领域的生产技术必须发生根本性变革。生物制造提供了更好的技术选择和解决方案，并已逐渐渗透到传统制造业中，能够减少能耗、物耗和污染物排放，大幅度降低生产成本，加速传统产业升级，将推进“绿色制造”，发展绿色GDP［1］。手性化学品是传统制造工业的重要产品之一，具有高度选择性的生物制造技术尤其适用于高光学纯度化学品的制造过程，大力发展手性化学品生物制造技术，将为构建可持续发展的和谐社会作出贡献。

生物制造手性化学品是以生物学、化学、工程学及信息学等学科的交叉为手段，以光学纯化学品的高质量合成为目标，以快速、高效、高选择性和绿色为特征，以蛋白结构分析、分子生物学、合成生物学、化学合成和反应工程学及系统工程理论等为技术手段，为手性化学品的清洁、高效、经济和快速生产提供创造性设计思想和新型科学方法。

1 发展手性化学品的生物制造符合国家重大需求

手性化学品广泛应用于医药、农业、食品、材料等领域，在国计民生中占据极其重要的地位。例如现在全世界已经上市销售的1 850种药物中，手性药物占1 045种，其中523种天然及非合成药物中99%为手性药物，1 327种合成药物中手性药物占40%［2］;世界上使用的2 000多种农药中，有25%是手性分子［3］;全球常用食品添加剂有5 000多种，其中很多重要品种，如氨基酸、乳酸、薄荷醇、酒石酸、三氯蔗糖等也都具有手性［4］;具有良好可降解性的生物材料替代传统材料是新材料领域发展的重要方向之一，手性是生物材料的主要特征之一。

随着工业化、城镇化和人口老龄化进程的加快，我国居民医疗卫生服务需求量增加，作为全世界人口最多的国家，目前我国药物市场居全球第7位，预计到2013年，中国药物市场将达到700亿美元，成为全球第三大市场［5］。我国又是一个农业大国，为了保障农业生产的正常进行，一系列农用化学品如杀虫剂、杀菌剂、昆虫性信息素和植物生长调节剂等被广泛使用，农药年需求量在30万t左右。2009年我国食品工业总产值超过5万亿元，食品添加剂主要产品产量达到586万t以上。据中国科技部《2009中国生物技术发展报告》预计，2010～2015年中国在医疗材料、一次性包装、日用品、无纺布等领域生物可降解材料需求量将超过450万t，而目前每年可供的生物材料产量不超过10万t。因此，研究、制造和使用光学纯化学品，对于保障我国国民健康，保护生态环境具有重要意义。

手性化学品的常用制造方法包括化学制造和生物制造，化学制造又包含有外消旋体拆分、手性源合成和不对称化学催化合成等方法，各种方法的优劣都非常明显。目前在工业应用中，物理和化学手性拆分工艺仍占主导地位，其次才是生物合成和不对称化学催化。从单一手性对映体占所有产品比例来看，目前手性化学品制造技术还远远不能满足市场对手性产品的需求。近年来，合成化学家发展了许多不对称催化法，将潜手性或者非手性底物转化为手性产品，这些发展对学术研究和工业生产都产生了巨大的推动作用。

迄今为止，能完成最好的不对称合成的无疑应首推自然界中的酶。发展高效高选择性的催化剂以期达到和酶一样的催化效果，是从事不对称催化的有机化学家所追求的目标［6］。相比之下，生物制造最大的特点在于:所用的酶是一种天然的手性催化剂，对手性化合物具有高度专一性识别作用，因而能够在温和的反应条件下实现化合物的高选择性(化学、立体以及区域选择性)转化，尤其适用于高光学纯度手性化学品的制造。生物制造因其无可比拟的选择性为手性化学品制备提供了与众不同的技术选择和解决方案。在研的准产业化规模的化学品生物制造过程中，至少有88%为手性化学品［7］。

综上所述，手性化学品影响着人类生活的各个方面，事关健康与环境等重要社会问题，发展生物制造手性化学品符合国家重大需求。

2 生物制造是实现手性化学品绿色制造的重要手段

目前，获得手性化学品的主要方法仍然是通过化学合成，然后在反应的最后阶段对相应的外消旋混合物进行拆分。以手性化学品为代表的精细化学品用途广泛、附加值高、产业关联度大，直接服务于国民经济的诸多行业和高新技术产业的各个领域，但是存在着资源消耗大、能耗高、污染重的问题［8-9］。精细化率已成为衡量一个国家或地区化工发展水平的重要标志，美国、西欧和日本等化学工业发达国家的精细化率已达到60% ～90%。例如德国CIBA公司作为精细化工的领先者，35%的销售额来自半特种化学品，65%来自特种化学品。我国精细化工现已具有相当规模，品种达30 000多种，生产能力近1 350万t/a，年产值超过1 000亿元，精细化率达到了40%，但与国外相比差距仍很大［8］。据统计，我国化学工业消费能源3.75亿t标准煤，占全国能源消费总量的15.2%。每年排放的工业废水达60亿t，占全国工业废水排放总量的20%，其中精细化工占据了相当大的比例。

为了更好地应对资源、能源和环境压力，维持生态和谐以及工业可持续发展，必须对手性化学品的生产过程进行技术革新和创新，实现手性化学品的绿色制造。生物制造是依托微生物与酶进行的现代制造技术，为实现手性化学品绿色制造提供了极大空间，几乎所有已知的有机反应类型都能找到相应的酶促反应过程。和其他技术相比，生物制造具有其特有的优势［10］，如催化效率高，反应条件温和，可以避免诸如分解、异构化、外消旋化及重排等副反应;酶由可再生生物质资源制得，本身无毒且能在环境中完全降解;由于其所具有的高选择性，不需要对活泼基团进行保护和脱保护等步骤，能够大大减少反应步骤;过程能耗低，设备腐蚀轻，生产安全性高，极好地符合了绿色化学原则［11］，正是人们所寻求的绿色化学过程。

随着技术研究的快速发展和逐渐深入，生物制造已经在手性化学品制造领域展现出过程绿色的优势［12］。以世界上第一个年销售额超过100亿美元的降血脂重磅炸弹药物阿托伐他汀(立普妥)为例，在合成关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯时，原有化学合成路线在较高的温度和碱性条件(80℃、pH 10)下进行，会产生较多与产物沸点很接近的高沸副产物，需要通过高真空精馏进行分离精制，整个过程收率受到严重影响。Codexis公司开发的两步三酶法新路线反应条件温和(40℃、pH 7)，催化效率很高，生物制造过程中还原反应的体积产率提高近100倍，氰化反应效率提高近4 000倍。副产物、废料量、溶剂用量和能耗均显著减少，废弃污染物易于进行生化处理，且不需要使用重金属催化剂和精制设备，更加快速、安全、高效和环境友好［13］，反应步骤和分离步骤均有所减少，总收率提高 50%，具有较高的“步骤经济性”(stepeconomic)。这一技术获得了2006年美国总统绿色化学挑战奖。

因此，通过技术创新，充分发挥生物制造固有的优势，发展手性化学品的生物制造技术，显著提高工艺集成度，大幅度减少合成步骤和复杂性，降低分离纯化难度，提高原子经济性和过程收率，并显著降低过程的资源能源消耗、污染排放，实现绿色制造，将成为我国手性化学品制造业快速、可持续发展的必然选择。

3 国外发展现状

3.1 生物制造手性化学品已成为世界各国重点研究的战略方向

目前，生物制造手性化学品已经成为发达国家的重要科技与产业发展战略，并受到世界各国的广泛关注。全世界已有5%的化工产品涉及生物制造，其中大部分过程均和手性化学品有关。据经济合作与发展组织(OECD)估计，这一比例到2030年可能达到35%［14］。美国国家科学研究委员会、工程技术委员会、制造与工程设计院编写的《2020年制造业挑战的展望》明确提出“生物制造(Biotechnology for Manufacturing)”为战略技术领域，将其列为11个主要方向之一。欧盟专门制订了工业生物技术计划，预计到2010年，工业生物技术生产的产品将占欧盟整个化学品产值的10%～20%［15］。欧盟科技发展委员会及其各国应用科学委员会在工业生物技术领域中都重点支持发展手性化学品的生物制造技术，在2004年“工业生物技术与化学持续发展”的报告中指出，手性化学品的生物制造技术将大大推动手性化学品在药物、农药和材料工业中的应用。日本学术振兴会在未来开拓学术研究推进事业中专门设立了“生命科学与化学手法融合进行新的有用物质生产”的专题，投入3.65亿日元。目前，在多个手性中间体的制造中已经取得成功。

生物制造手性化学品已经成为各大跨国公司发展的战略制高点。在欧美发达国家，生物制造技术已逐渐应用于手性化学品的规模化生产，开始进入包括手性药物、手性精细化学品和手性材料在内的很多领域。德国BASF是世界领先的化学公司之一，已经在生物制造手性中间体方面形成了自己的研发实力和核心技术，其产品包括手性胺、醇、酸衍生物，生产规模从几吨到数千吨。由BASF公司开发的VB2生物转化过程替代了原有的8步化学过程，废水排放减少66%，废气排放减少50%，成本降低了 50%，目前全球产量已超过 8 000 t/a［16］。Degussa公司精细化学品部集中生产手性化学品，通过生物法及化学法和酶法结合生产多种手性氨基酸、手性药物中间体和活性药物成分，通过多年研究，开发了生物法制备手性化学品的多项关键技术。Degussa公司已经通过创建含有亮氨酸脱氢酶和FDH的细胞系统，利用甲酸铵盐作为共底物催化还原氨基化，大量生产L-新戊甘氨酸，对映体选择性超过99%，转化率达到95%以上［17］。BioVerdant生物技术公司致力于从手性产品设计路线上就考虑化学过程和酶过程的组合，已经成功改进了数种产品的生产路线，提高了生产效率［18］。在抗癫痫药普瑞巴林的合成中，改进后的生物制造工艺和现有化学合成路线相比，溶剂使用量和原材料消耗量显著降低，以现在产量计算，每年可以减少甲醇、乙醇和异丙醇的用量总计达4万t，减少四氢呋喃用量1万t，同时还能够使S 扁桃酸和镍的用量分别减少1 600 t和500 t，消旋原料的消耗也减少了800 t［19］，这一成果荣获了2006年欧洲最高绿色化学奖(2006 IChemE AwardinGreenChemistryand Engineering)。

3.2 现代生物技术的进步是生物制造手性化学品快速发展的新驱动力

蛋白结构分析、生物信息学和分子模拟等技术的新发展为解析生物催化剂的手性识别机制奠定了基础。最近在生物技术方面取得的突破性进展，如公共基因数据库(GenBank)和蛋白质数据库(PDB)中序列的指数增长，以及生物物理学、化学生物学、计算生物学、结构生物学、重组蛋白表达、高通量筛选、DNA测序以及酶定向进化和表达平台的建立，为高效快速开发适合目标反应的新酶提供了便利［10］，大大推动了立体选择性酶不对称合成手性化合物的分子催化机制研究，基于此，在提高酶蛋白的选择性、活性、稳定性等方面获得了较大的进展，成为国际研究热点。科学家正通过蛋白质结晶学和结构生物学技术手段(X线衍射晶体学或核磁共振)直接从立体选择性酶的高级结构出发，尝试解析酶蛋白分子及其结合底物分子复合物的空间结构，发现酶蛋白分子的关键功能域，如催化活性中心、底物结合域等及其与小分子空间嵌合的不对称结构与功能关系，并已取得一定进展。但是因为生物反应体系的复杂性，导致酶、辅酶和底物的复合体系的结晶与结构解析尚具有较大的难度。通过上述技术手段，已对氧化还原酶活性中心关键位点的作用机制形成一些规律性的解释，如短链脱氢/还原酶(SDR)催化关键位点Asn-Ser-Tyr-Lys中Tyr起催化基的作用，Ser稳定羰基底物，Lys与辅酶作用，而Asn通过水分子结合Lys活性位点，通过这种方式关键氨基酸与辅酶以及水分子形成了有机协调的电子传递系统［20］。目前，仅有少数几种立体选择性酶及其底物/辅酶复合物获得了结构解析，发现了酶的关键催化位点并从分子水平解释了酶催化不对称反应的作用机制［18］。根据蛋白质数据库中已有蛋白高级结构模型，通过可视化分子模型拟合分析和蛋白质工程分子改造手段，能够有效研究酶蛋白结构中与生理生化性质和催化功能密切相关的功能域中关键氨基酸位点及其空间构象与底物分子的识别和相互作用关系，进行催化功能底物谱预测并用于高通量靶向筛选。Heuvel等［21］揭示了酶蛋白结构上的微小改变即可导致其催化功能的显著变化。Zhu等［22］通过酶蛋白-底物嵌合模型拟合和定点突变分析，预测受体分子结合域、辅酶结合位点以及底物结合疏水通道，并通过饱和定点突变发现了对于决定酶的对映选择性具有关键作用的位点。

合成生物学、计算生物学和生物反应热/动力学的新成果为实现生物合成反应的设计与调控提供可能。利用合成生物学原理在易进行基因操作的宿主微生物中异源表达整个或部分生物合成途径已经成为越来越普遍的方法，这一技术能够有效应用于手性生物合成反应体系设计及其构建，并且所开发的生物催化剂可用作催化类似反应的平台催化剂和反应模块，所合成一系列产品可作为手性砌块使用［23］。Keasling关于合成抗疟疾药物青蒿素的研究成果是合成生物学的经典之作。经过不懈的努力，成功实现了来自细菌、酵母与青蒿(高等真核生物)多种基因及生物合成途径的设计组装与精密调控，使得用大肠杆菌及酵母细胞合成青蒿素前体——青蒿酸的能力有几个数量级的提高［24］。

针对外在因素如何影响酶促反应过程以及如何实现过程的有效调控等问题，国内外也开展了不少相关的研究。热力学数据对于预测酶促反应可行性和平衡位置起着重要作用。Goldberg针对生物技术领域需要计算反应能量消耗和优化反应得率的要求，创建了一个较为完整的酶催化反应热力学数据库(http:∥xpdb.nist.gov/enzyme_thermodynamics/)，涵盖了1 206种反应物和518种酶。但是目前该数据库收集的反应主要涉及天然底物，针对非天然底物的手性合成反应方面的数据还很少。近年来，通过模拟方法能够了解催化过程的过渡态结构，探明某一具体残基对酶反应的影响机制，建立外在因素对酶反应的关联模型。例如可以通过量子力学/连续介质力学计算典型催化三联体SER-HIS-ASP与乙醇或乙腈分子的相互作用，揭示质子溶剂和疏质子溶剂对过渡态稳定性的不同影响，从而为催化介质的选择提供理论依据。在此基础上，人们开始应用热力学计算和计算生物学等手段提高酶促反应的效率，出现了一些成功的案例。Fesko等［25］计算了4种苏氨酸醛缩酶催化不同对映体的活化能，发现了反应限速步骤，为从热力学和动力学角度调控苯甲醛和甘氨酸的醛缩反应奠定了理论基础。Magnusson等［26］通过生物物理手段理性设计了酶的结构，并通过热力学分析指出对映选择性随着温度的增加而提高。这些成功的案例引起了科学家们的高度关注，也引发了酶促反应理性调控研究的热潮。

多酶耦合、化学 酶法协同催化以及过程工程集成、优化与调控的新技术为设计和构建手性生物制造系统提供借鉴。最近，利用2种及以上的生物催化剂来对先导化合物进行高效、连续结构修饰的组合生物催化技术也正在国际上兴起，这一技术能够快速产生大量的衍生物分子库来进行高通量筛选。在具有复杂结构的手性化学品合成中，通过生物合成与化学合成的有机结合，充分发挥二者各自的优势，由此形成了化学-酶法技术，体现出了极大的优越性。Burda等［27］通过集成耦联反应和乙醇脱氢酶不对称还原开发了手性联芳醇的合成工艺，转化率可达91%，e.e.值高达99%，解决了化学催化和生物催化的相容性。Baer等［28］开发了不对称化学催化-生物催化反应模块化组合，高效合成了4种光学纯1，3 -二醇立体异构体，而且有机合成的反应液与后续的酶还原反应相容。此外，在反应工程、过程工程和集成研究方面也取得了大量成果，如开发了自动化高通量微滤实现原位底物流加和产物回收、树脂原位吸附等反应分离耦合技术［29］，已经成功用于环戊酮单氧酶催化的Baeyer-Villiger反应。因此，生物制造系统的设计、开发和改造技术以及过程工程的进步和发展，为手性化学品生物制造以及工业化生产提供了有力的技术支撑。

4 国内研究现状和进展

我国发展生物制造手性化学品的最大推动力来自于保障国民健康和保护生态环境的迫切需求。为了提升相关技术的原始创新能力，我国许多大学和研究机构在基础研究和产业化开发方面开展了大量工作，已取得许多可喜成果，如生物法生产D-泛酸及D -泛醇的产量已达5 000 t/a，居世界第一(该技术获得了国家技术发明二等奖)。此外，在生物合成机制研究、生物反应模型构建、生物制造系统构建及调控、优化等方面，尽管是处于起步阶段，进展却非常迅速。

目前，国内研究人员围绕手性生物制造的分子机制、手性生物合成反应的调控机制和手性生物制造系统的设计原理与方法等进行了大量卓有成效的研究工作。在手性识别规律解析、生物催化剂理性设计、反应调控、典型生物制造过程重构等方面取得了较大进展。

以环氧水解酶、羰基还原酶、醛缩酶等手性生物催化剂为研究重点，解析酶蛋白及其与手性分子复合物的结构。羰基还原酶是手性合成中的重要酶类，通过同源建模、分子对接与空间构象分析的手段，发现了立体专一性羰基还原酶中对酶的底物专一性和立体选择性具有影响作用的新的催化位点，在国际上处于领先地位;揭示了底物通道识别、辅酶空间位阻、分子手性识别等分子互作机制;在揭示生物催化剂与手性小分子的选择性识别规律和作用机制基础上，研究典型酶蛋白(如醇脱氢酶、羰基还原酶、脂肪酶等)与环境的互作对三维结构的影响，阐述酶蛋白分子中与手性底物相互作用的微观结构，采用理性与半理性技术设计酶分子改造策略，对目标酶分子进行定点突变，基于蛋白分子活性表达获得具有目的催化功能的生物催化剂突变体，构建醇脱氢酶、羰基还原酶、脂肪酶等生物催化剂库及其突变体库，提高蛋白分子的适用性和稳定性，实现手性生物催化剂的功能强化［30-32］。构建了水解拆分、不对称还原、C—C缩合等单元反应，针对醇脱氢酶催化不对称还原过程展开了溶液体系中酶微观构象影响机制的谱学研究;通过热/动力学分析研究了外在因素对醇解反应对映选择性的影响规律，初步实现了单元反应的理性调控［33］。设计并初步构建了手性砌块库、反应模块库和对接技术，包括合理组装不同的生物转化过程和化学转化过程构建酶化学级联反应模块库;基于手性识别机制，利用蛋白质工程理性设计与分子改造技术，开发系列结构可调、功能改进的工业酶，拓展其过程适应性，强化反应相容性，构建多酶反应模块库［34-37］;构建手性醇、手性酸以及多反应基团化合物卤代醇、卤代酸等系列手性砌块库。在此基础上，采用官能团、手性中心、有效前体等拆分策略，基于手性化学品逆合成分析方法构建手性化学品合成路线网络，发掘关键合成节点((S )-环氧氯丙烷、(S)-4-氯-3 -羟基丁酸乙酯、(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯、6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯、(R-)1，3-丁二醇、(2S)-苯甲酰胺甲基-(3R)-羟基丁酸甲酯等)，运用模块化组装策略，以大宗化学品为原料，以羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶、卤醇脱卤酶、环氧水解酶、腈水解酶为主要元件的反应模块为工具，实现了典型手性化学品阿托伐他汀、美罗培南生物制造过程重构。

总体来说，目前我国的手性化学品生物制造技术在原创性基础研究和技术创新性研究两方面与世界先进水平仍有较大差距，还缺乏系统的技术平台和设计理论体系，尚不能为建设重要手性化学品的先进绿色生物制造产业提供全面的技术支撑。

5 生物制造手性化学品的主要发展方向和趋势

目前国内外关于生物制造手性化学品的研究已经有了一定的基础，但还没有形成完整的理论体系，未来的研究将主要从以下几个方向展开:①高选择性生物催化剂的结构与功能关系。生物学科在研究手段和分子层次模拟上取得的进步，为研究人员基于分子生物学实验方法和生物信息学计算过程揭示生物制造中立体选择性实现的分子机制并进行有效调控提供了技术保障;在此基础上，能够利用已知的酶种，进一步探讨其在各种立体选择性反应中的新应用，发展新的反应类型;从分子结构水平研究和模拟酶选择性实现的蛋白三维结构，进而理性设计并高效、快速开发高选择性生物催化剂。②手性生物合成反应过程的研究。当前可供选择的手性生物合成途径十分有限，导致生物合成固有的高效率未能发挥应有的效果。对基元生物反应和复杂反应体系进行热力学和动力学研究，可为手性化学品生物制造的最优路线设计提供相关基元生物反应的基础科学数据。日益丰富的手性生物合成反应信息库为开发手性基元生物反应提供了物质保障，可通过生物信息学理论模拟和定点突变等手段提高酶在工业环境中的选择性，拓展生物催化剂工业生产手性化学品的应用;或者通过对底物的结构作局部修饰与调整，使其更加适合于特定生物制造体系，提高手性合成反应的效率。③生物制造体系的系统性研究。目前单纯着眼于局部反应步骤效率的研究方法使各单元反应不能充分发挥各自的优势，由于缺乏相关的技术平台和工程科学方法，无法实现有效组合。因此，从系统层面出发，考虑产品合成路线，充分发挥生物制造和化学合成的优势，整合化学和生物过程，结合过程调控和集成技术，提高化学品生产体系效率［10］;建立过程组合、评估和重构标准，快速评价合成过程的综合效率，这样一种整体设计理念也已受到越来越广泛的关注。

随着我国人口健康和环境问题的日益严重，生物制造手性化学品的重大意义愈发明显，特别是基础研究显得尤为紧迫。我国如能针对上述几个重要问题进行深入研究并取得重大突破，就能够在激烈的国际竞争中占据先机，为后续产品开发和过程革新等应用研究奠定坚实的理论基础，最终实现生物制造手性化学品的广泛工业应用。

6 展望

当前，我国制造业正面临许多重大挑战及关键发展机遇。生物制造手性化学品不仅可以满足国家对手性化学品的需求，而且可以促进我国传统化工行业产业升级和可持续发展，打破国外专利封锁，打造节能减排降耗的清洁化工制造业。因此，积极开展生物制造手性化学品的基础研究符合我国国情和国家发展目标，是非常迫切和重要的。国内队伍团结、手段齐全，相关技术已有一定积累，和国际交流密切，进行多学科交叉研究的时机已经成熟，具备了实现创新跨越的潜力。面对发展生物制造手性化学品的极好机遇，在与发达国家处在相近的起跑线上，我国应全局性、战略性地选择重大科技方向，发挥我国现有的资源优势、政治优势，在新世纪国际竞争中取得领先地位。

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