生物丁醇代谢工程的研究进展

戴宗杰，董红军，朱 岩，张延平，李 寅

(1.中国科学技术大学 生命科学学院，合肥 230026;2.中国科学院 微生物研究所，北京 100101)

化石能源的不断减少及环境问题的日益加重，迫使人们寻找可持续的方法来维持世界的发展。利用可再生资源生产石油基化学品是一种重要的可持续发展途径。丁醇作为一种大宗化学品，既是生产许多化合物的重要原料，也是一种潜在的动力燃料或者燃料添加剂。相对于燃料乙醇，丁醇具有更高的能量密度，更强的疏水性，同时不具有腐蚀性，可以延长运输管道的使用寿命，可以直接使用而无需改造现有的动力引擎［1］。所以近年来，利用生物法生产丁醇受到人们的普遍关注。

ABE(acetone-butanol-ethanol)发酵是生物法生产丁醇的最主要方法，这一方法已经有近百年的历史。工业上用来生产丁醇的菌株主要有丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、拜 氏 梭 菌 (C.beijerinckii、C. saccharoperbutylacetonicum 和 C.saccharobutylicum)等菌株，其中对丙酮丁醇梭菌的研究最为深入。1992年，Mermelstein等［2］第一次实现了对丙酮丁醇梭菌ATCC 824的遗传改造。2001年，丙酮丁醇梭菌基因组测序完成［3］。此后，通过代谢工程改造丙酮丁醇梭菌生产丁醇取得了巨大的进步。

然而，与其他模式菌株相比，丙酮丁醇梭菌缺乏高效的遗传改造工具。同时，作为革兰氏阳性厌氧菌，丙酮丁醇梭菌的遗传操作更加复杂。近年来，许多研究组在其他模式菌株中成功构建了来源于丙酮丁醇梭菌的丁醇生产途径［4－9］，一些新的丁醇生物合成途径也被设计出来［10－11］。笔者对代谢工程改造丙酮丁醇梭菌和其他模式微生物生产丁醇进行总结，比较了不同微生物生产丁醇的问题，并展望了生物丁醇的未来发展方向。

1 利用丙酮丁醇梭菌生产丁醇

丙酮丁醇梭菌是生产丁醇的天然菌株，其丁醇代谢途径已经得到了充分解析，如图1所示。通过糖酵解产生的丙酮酸，在丙酮酸铁氧化还原蛋白的作用下生成CO2和乙酰辅酶A。2个乙酰辅酶A分子通过硫解酶聚合形成乙酰乙酰辅酶A，乙酰乙酰辅酶A经过还原、脱水、再还原三步催化之后生成丁酰辅酶A，然后在醇脱氢酶的作用下产生丁醇。这一丁醇生产途径称为梭菌丁醇途径。丙酮丁醇梭菌在产生丁醇的过程中也会产生一些副产物，主要包括乙酸、丁酸、乙醇和丙酮，并且会释放出H2以及CO2。

图1 经典的丙酮丁醇梭菌代谢途径Fig.1 Classical metabolic pathway of Clostridium acetobutylicum

随着丙酮丁醇梭菌遗传改造工具的发展，特别是II型内含子技术在丙酮丁醇梭菌中的成功应用，使得快速定向改造代谢支路成为可能。pta基因和ack基因是生产乙酸的2个必须基因，其中Pta蛋白将乙酰辅酶A转化为乙酰磷酸，然后通过乙酸激酶(Ack)产生乙酸。Lehmann等［12］的工作显示，pta 基因突变体的丁醇生产能力没有明显变化;而另外一个研究组用II型内含子的方法插入失活了pta基因，pta基因突变体的丁醇生产能力却提高了46%［13］。ack基因突变体的丁醇产量提高了16%，乙醇产量则提高了63%［14］;另外一项研究也显示了类似的结果［15］。

从丁酰辅酶A到丁酸也需要2个酶的催化，分别是ptb基因编码的丁酰磷酸转移酶和buk基因编码的丁酸激酶。ptb基因突变体的乙醇产量达到12 g/L，远远高于野生型菌株，而丁醇的产量下降到了8 g/L［16］。但是 Jang 等［13］的工作显示，ptb 基因突变体的乙醇产量只有0.9 g/L，而丁醇的最终质量浓度为13.9 g/L。这种差异的原因还不清楚，可能是由于基因插入失活的位点不同，导致蛋白酶活有差异;另外发酵条件的区别也可能是原因之一。生成丁酸的第二个酶丁酸激酶也有类似的研究。当该酶基因被插入失活后，丁醇的产量达到15.2 g/L，比对照菌株的产量提高了29%［13］。

丙酮丁醇梭菌的另外一个代谢支路是产生丙酮，该支路包括2个酶:酰基转移酶和乙酰乙酸脱羧酶，分别由ctfAB基因和adc基因编码。其中ctfA基因突变体丧失了丙酮生成能力，其丁醇和乙醇的生成能力相比对照菌株也下降很多;而adc基因突变体依然可以产生少量的丙酮，产醇表现则类似于ctfA基因突变体［12］。这一结果和另外2个研究结果类似［15，17］。ctfB 基因突变体的代谢表型类似于ctfA基因突变体［13］。之所以产丙酮途径被敲除后产醇量降低，是因为丙酮生成途径和酸吸收是耦联的，而酸吸收又与产醇相关联。

当丙酮生成途径被阻遏后，酸吸收能力减弱，产醇能力相应被削弱。Jang等［13］将通过酸吸收产醇的途径称为冷通道(cold channel)，将乙酰辅酶A到丁酰辅酶A然后生成丁醇的途径称为热通道(hot channel)。将酸产生途径中的pta基因和buk基因进行了双敲除，增强热通道的代谢流，同时表达醇脱氢酶 adhE1的突变体，该突变体对 NADH和NADPH都有很好的亲和力，从而增强了对热通道的驱动力。该研究中丁醇的产量提高到了18.9 g/L，对葡萄糖的转化率达到31.2%。相对于野生型菌株，这2个指标分别提高了160%和245%。这也是迄今为止通过代谢工程手段获得的丁醇产量和转化率最高的丙酮丁醇梭菌突变体。

2 利用大肠杆菌生产丁醇

大肠杆菌作为一种典型的模式菌株，其遗传背景、遗传改造工具和遗传改造过程相比于丙酮丁醇梭菌都更加清晰、更加丰富、更加容易。近些年来，利用大肠杆菌生产丁醇取得了巨大的进步。不仅丁醇产量和转化率达到了丙酮丁醇梭菌的水平，而且在代谢途径优化和设计方面也获得许多成功，为微生物生产丁醇提供了新的方向。以下从3种丁醇生成途径详细介绍利用大肠杆菌生产丁醇的最新进展，大肠杆菌中优化的梭菌产丁醇途径如图2所示。

2.1 优化的梭菌途径

图2 大肠杆菌中优化的梭菌产丁醇途径Fig.2 Optimized clostridial butanol production pathway in E.coli

James Liao研究组首先实现了在大肠杆菌中生产丁醇。丙酮丁醇梭菌产丁醇途径中的hbd、crt、bcd、etfAB和adhE2基因在大肠杆菌中被成功表达，同时表达大肠杆菌自身的硫解酶基因atoB，打通了丁醇生物合成通道。进一步敲除了大肠杆菌内部的一些竞争途径的基因，包括:adhE、ldhA、frdBC、fnr、pta。该重组菌株在 M9培养基中产生了113 mg/L的丁醇，在丰富培养基TB同时添加甘油的条件下，该菌株可以生成552 mg/L的丁醇［4］。

为了进一步提高丁醇产量，催化糠醛辅酶A到丁酰辅酶A的Bcd/EtfAB蛋白复合体被替换为来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的Ter，因为前者的催化反应是可逆的，而后者不可逆，从而可以增强丁醇代谢流。同时表达了大肠杆菌自身的硫解酶基因phaA和丙酮酸脱氢酶复合体aceEF-lpd操纵子，在没有对宿主菌自身进行改造的情况下，大肠杆菌的丁醇产量达到了4.65 g/L［18］。这与丙酮丁醇梭菌野生型丁醇产量13 g/L相比仍有较大差距。

在进一步的工作中，James Liao研究组将增强NADH和乙酰辅酶A的供给作为两个驱动力引入大肠杆菌，以增强丁醇代谢流。他们在大肠杆菌中表达甲酸脱氢酶，催化丙酮酸甲酸裂解酶生成甲酸的同时，形成还原力NADH，并敲除菌体自身消耗还原力的途径:琥珀酸生成途径、乳酸生成途径和乙醇生成途径(ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdBC)。菌体为了保持氧化还原的平衡，必须通过产生丁醇来消耗过多的NADH。他们还敲除了大肠杆菌自身的pta基因，增加乙酰辅酶A的供给。另外，他们还将Bcd/EtfAB蛋白复合体替换为Ter蛋白，以进一步增强丁醇代谢流。该重组突变体在丰富培养基TB同时添加甘油的条件下，丁醇产量达到15 g/L［19］。

2.2 脂肪酸β氧化反转途径

脂肪酸β氧化反转途径类似于梭菌途径，该途径是将脂肪酸β氧化途径逆转，将途径中的丁酰辅酶A转化为丁醇。但是在正常代谢过程中，脂肪酸β氧化途径是用来降解长链脂肪酸的，而该途径需要在脂肪酸作为C源的情况下才能被激活。为了利用非脂肪酸C源(例如葡萄糖)通过该途径生产丁醇，必须对大肠杆菌C源代谢、脂肪酸代谢相关的调节基因以及脂肪酸β氧化途径的代谢基因进行改造(图3)。

图3 脂肪酸β氧化反转产丁醇途径动态Fig.3 Butanol producing pathway by fatty acid β oxidation

Gonzalez研究组通过引入fadR和atoC(c)2个突变体，实现了在非脂肪酸存在情况下β氧化系统fad和ato调节子的组成型表达;将大肠杆菌自身的crp基因替换为cAMP不依赖的突变体crp*，解除了葡萄糖为C源时对β氧化相关酶的C代谢阻遏;敲除arcA基因，解除了ArcA蛋白对β氧化相关操纵子的抑制。此外，还敲除了乙醇、乙酸和琥珀酸等大肠杆菌中丙酮酸的其他代谢支路(包括基因pta、adhE和frdA)。但是在这种遗传背景下，重组大肠杆菌并不能生产丁醇。为了生成丁醇，表达了大肠杆菌自身的硫解酶和醇脱氢酶，最好的组合产生了1.9 g/L丁醇和1.2 g/L乙醇。为了减少乙醇产量，敲除了大肠杆菌自身的利于乙醇生成的醇脱氢酶EutE和YqhD，该重组菌株在摇瓶产生了2.2 g/L的丁醇;在发酵罐中产生了14 g/L丁醇，对葡萄糖的转化率达到了33%［11］。

2.3 2 -酮酸脱羧途径

2 -酮酸是氨基酸代谢中间体，在2 -酮酸脱羧酶的作用下生成相应的醛，然后通过醇脱氢酶生成相应的醇。2-酮戊酸是丁醇生成的直接前体，2-酮戊酸由2 -酮丁酸通过IPMS碳链延伸途径形成。2-酮丁酸有2种生成途径:苏氨酸途径和柠苹酸途径，如图4所示。

图4 2-酮酸脱羧产丁醇途径Fig.4 Butanol producing pathway by 2-keto acid decarboxylation

2.3.1 通过苏氨酸途径、IPMS碳链延伸途径和2-酮酸脱羧途径产丁醇

James Liao研究组首先在大肠杆菌中过表达了2种2 -酮酸脱羧酶Kivd和Aro10，这2种重组菌株分别产生0.016 g/L和0.007 g/L丁醇。为了提高丁醇的前体2 -酮戊酸的量，负责将L -苏氨酸化为2 -酮丁酸的IlvA蛋白被过表达;同时IPMS碳链延伸途径也被过表达，这样就可以将2-酮丁酸转化为2-酮戊酸。通过该步优化，该大肠杆菌重组菌可产生0.04 g/L丁醇。将L-苏氨酸作为底物加入培养基后，丁醇产量达到0.24 g/L。为了解除底物2-酮异戊酸、2-酮-3-甲基戊酸和2-酮-4-甲基戊酸对IPMS碳链延伸途径和2-酮酸脱羧途径的竞争性影响，ilvD基因被敲除，这样丁醇产量达到了0.67 g/L［10］。

Shen等［20］也利用该途径生产丁醇，不过 ilvD基因没有被敲除。表达了thrAfbrBC基因，从而解除了由L-苏氨酸导致的苏氨酸代谢相关基因的转录沉默，以及L-苏氨酸对ThrA蛋白的反馈抑制。在敲除了苏氨酸代谢竞争途径的2个基因metA和tdh以及其他代谢支路(ilvB、ilvI和adhE)后，丁醇产量达到了1 g/L。

2.3.2 通过柠苹酸途径、IPMS碳链延伸途径和2-酮酸脱羧途径产丁醇

除了可以通过苏氨酸产生丁醇的前体2 酮丁酸外，柠苹酸途径也可以生成2-酮丁酸。在柠苹酸合酶作用下，丙酮酸和乙酰辅酶A缩合形成柠苹酸，然后通过蛋白LeuCD和LeuB催化形成2 酮丁酸。2-酮丁酸通过IPMS碳链延伸途径和2 酮酸脱羧途径产生丁醇。为了提高柠苹酸合酶在大肠杆菌中的酶活，研究者利用定向进化的方法筛选出了最佳的柠苹酸合酶突变体，同时解除代谢之路(ΔilvB和ΔilvI)的竞争作用，最终的丁醇产量达到524 mg/L［21］。

3 利用其他模式菌株生产丁醇

除了在大肠杆菌这种常见的模式微生物中进行丁醇生产外，其他常见模式微生物也被用来生产丁醇。Keasling研究组首先在酿酒酵母实现了丁醇的产生。之所以选择酿酒酵母作为改造宿主，是因为酿酒酵母的遗传背景清楚、遗传改造工具成熟、工业化经验丰富而且具有很高的丁醇耐受性。他们组合了来源于不同微生物的酶，来构建优化的梭菌丁醇途径。其中最好的组合是来自酿酒酵母自身的硫解酶Ergi0、来自丙酮丁醇梭菌的3 -羟基丁酰辅酶A脱氢酶Hbd和醇脱氢酶AdhE2以及来源于山丘链霉菌的丁酰辅酶A脱氢酶Ccr。采用该组合构建的重组酿酒酵母，可产生2.5 mg/L的丁醇［22］。

假单胞菌和芽胞杆菌是天然的溶剂耐受菌株［23］。Nielsen 等［9］选择恶臭假单胞菌和枯草芽胞杆菌进行丁醇代谢改造。其中表达了来源于丙酮丁醇梭菌的 thil、hbd、crt、bcd、etfAB 和 adhE1 基因的重组恶臭假单胞菌，在含有甘油的培养基中产生122 mg/L 丁醇。表达 thil、hbd、crt、bcd、etfAB 和adhE2基因的重组枯草芽胞杆菌，在含有甘油的培养基中可以产生24 mg/L丁醇。

乳酸菌也是一种常见的模式微生物，该菌的遗传背景清楚，遗传操作成熟而且丁醇耐受性强。其中短乳杆菌底物利用更加广泛，可以同时利用五碳糖和六碳糖。研究者将来源于丙酮丁醇梭菌的thil、hbd、crt、bcd、etfAB 基因导入短乳杆菌中，利用其自身的醇脱氢酶。重组短乳杆菌可以利用葡萄糖产生300 mg/L 丁醇［7］。

除了这些异养微生物被改造产丁醇，自养微生物蓝藻也被代谢改造产丁醇。蓝藻通过光合作用进行生长的同时，固定CO2产丁醇，理论上具有更低的成本。Lan等［5］将优化的梭菌途径(atoB、hbd、crt、ter和adhE2)导入集球藻 PCC 7942中，该藻最终产生了14.5 mg/L丁醇。为了进一步提高丁醇产量，ATP驱动力被引入该藻中。研究者首先将乙酰辅酶A通过乙酰辅酶A羧化酶转化为丙二酰辅酶A，这是一个消耗ATP的不可逆反应，然后通过脱羧将丙二酰辅酶A与乙酰辅酶A聚合为乙酰乙酰辅酶A。再将梭菌途径中依赖NADH的脱氢酶替换为依赖NADPH的脱氢酶，最终优化的代谢重组蓝藻可以产生30 mg/L 丁醇［7］。

4 丁醇代谢改造中存在的问题

实现生物丁醇的商业化生产，是这些研究工作的最终目的。尽管目前酿酒酵母、短乳杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽胞杆菌以及蓝藻的丁醇产量都很低，但是这些微生物都有不同的优势，或者对廉价底物的利用能力很强，或者对丁醇有很高的耐受性。随着合成生物学的发展，可以预见这些宿主生物合成丁醇的能力会不断提高。

虽然大肠杆菌的丁醇生产能力已经达到野生丙酮丁醇梭菌的水平，同时具有更高的丁醇转化率，但是利用大肠杆菌产丁醇还是存在一些问题。首先，这些大肠杆菌产丁醇的研究工作中所用的培养都是丰富的培养基。因此进一步改造大肠杆菌底物利用性是非常必要的。最重要的一点是，在大肠杆菌发酵产丁醇过程中有2个阶段:好氧生长和微好氧产丁醇。好氧发酵对于工业应用会消耗更多能量，增加生产成本。所以将这两阶段发酵改造为厌氧发酵是大肠杆菌产丁醇代谢改造的重要方向。

对于丙酮丁醇梭菌来说，一个最重要的问题就是如何将传统的两阶段发酵(产酸期和产醇期)改造为同型丁醇发酵。从计量学上来说，1 mol葡萄糖产生1 mol丁醇，其氧化还原是平衡的，其中的难点是如何改造氢酶。因为梭菌自身的氢酶会消耗还原力产生H2。虽然以前的工作已经证明抑制氢酶活性可以提高丁醇选择性［24－25］，但是到目前为止，还没有完全敲除或者抑制氢酶的报道。转录组学研究显示氢酶在指数生长期表达，其后的表达一直受到抑制［26］。因此，阐明氢酶表达调节机制将会为改造氢酶提供新的改造方法。在指数生长期增加还原力消耗途径也许也可以为敲除氢酶提供帮助。

由于ABE发酵中原料成本占总成本的80%左右［27］，原料成本很大程度上制约了生物丁醇的持续生产，从而导致生物丁醇市场竞争力弱。利用便宜的工农业废弃物例如玉米芯、秸秆、废甘油、含碳气体(CO2/CO)等，都有可能降低生物丁醇的原料成本，增加生物丁醇对石化丁醇的市场竞争力，从而推动生物丁醇产业的发展。近些年来许多工作已经利用木质纤维素水解液生产丁醇。中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所杨晟研究组对丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的木糖利用能力进行改造，实现了对木质纤维素水解液中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的共利用，同时菌株的丁醇转化率也得到了提高［27－29］。除了木质纤维素水解液，合成气也是一种非常有利用前景的原料。利用合成气生产乙醇已经进入商业化阶段［30］。也有文献报道一些微生物可以利用合成气产丁醇［31－33］，虽然丁醇产量很低，但由于原料供应方便，这将是一个非常有竞争力的研究方向。

综上所述，将大肠杆菌的好氧发酵产丁醇改造为厌氧发酵产丁醇、将丙酮丁醇梭菌两阶段发酵改造为同型丁醇发酵，是下一步代谢工程改造的重要方向。另外，降低原料成本，利用合成气生产丁醇将是代谢工程改造的另一个重要方向。有理由期待，在这些方向取得突破，将有助于推动生物丁醇产业的发展。

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