生物反应器及其研究技术进展

王永红，夏建业，唐 寅，杭海峰，易小萍，潘 江，许建和，张嗣良

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

1 生物技术产业发展与生物反应器

随着全球社会经济快速发展，现有石油煤炭等化石资源的充分供应变得不可持续，难以支撑人类社会的高级发展目标。人类社会发展将从依赖于化石燃料等碳氢化合物资源转变为依靠淀粉、纤维素、多糖、植物和微生物油脂等可利用太阳能持续合成的碳水化合物资源。这种能源和资源结构的转变将为生物技术及其产业发展带来极大机遇和挑战。

借助于各种生物系统可利用碳水化合物来规模生产现代社会所需的化学品和能源。这些生物系统包括酶、微生物、动物细胞、植物细胞和动植物组织。而生物系统进行物质转化的生化反应是在生物反应器这个相对封闭的小生境中进行的。生物反应器为生物系统的生化反应提供了可控的环境条件以促使生物过程高效进行，例如，温度、pH、溶氧、混合、剪切、补料等。另外，生物反应器系统供氧与混合效率、操作稳定性和可靠性与生物制造过程节能降耗密切相关，对生物产品生产成本产生很大影响。因而生物反应器设计、放大和操作优化技术及其产业化生产在生物产业发展中起着重要作用。

传统反应器一般包括悬浮培养系统反应器和固定化培养系统反应器。前者主要包括搅拌式反应器、气升式反应器;后者主要包括膜反应器、填充床反应器。随着全球对生物技术包括生物基产品需求的快速增长和生物技术相关学科发展，生物反应器出现了一些新的发展趋势，主要表现为高通量、微型化生物反应器应用于生物过程工艺快速开发和优化;工业规模生物反应器朝着大型化、自动化方向发展，并且计算流体力学技术被应用于反应器设计与放大，增强了对于生物反应器供氧、混合与剪切性能的可预期性;对于生物加工过程高密度高产率要求，使得包含新型空气分布系统与搅拌系统有机组合的生物反应器得到了广泛的应用，极大地提高了能源使用效率;多种先进传感技术被运用于生物过程的在线测定，提高了对于生物过程生理代谢状态认识的准确性和即时性;而针对具体培养对象的特殊性，出现了一些专门反应器，如光生物反应器、动物细胞一次性反应器、酶反应器等，这些新型生物反应器也正逐步实现工业规模应用。

另外，不同于一般化学或物理过程，生物反应过程涉及基因、蛋白、代谢以及细胞与环境相互作用相关的关系，因而很难用普适公式来总结描述其过程并为生物加工过程相关工程及反应器设计提供理论依据。继续研究生物反应过程基本规律及其新的表征方法是生物反应器工程及其应用获得根本重大进展的基础。在目前阶段，发展生物加工过程新型传感技术、研究可对生物过程进行表征的状态参数群并确定影响工艺优化及反应器放大的敏感参数，已被证明是针对生物加工过程的一种行之有效的工程学方法［1］。

笔者在关注生物反应器设计、放大和检测、控制等关键技术的同时，着重阐述应用于生物技术产品生产的生物反应器的主要发展趋势。

2 以代谢流分析为核心的生物反应器系统

2.1 系统设计原理及构成

生物过程是生物系统在生物反应器中进行生化反应的过程。生物反应器中生物系统及其所处环境构成了相对封闭的生态系统。在这一生态系统中，生物系统与环境因子间存在相互作用。生物系统，特别是以细胞为主体的生物系统，其表型不仅与基因型密切相关，也与细胞所处的微观或宏观环境条件(营养种类、pH、温度、溶解氧、生物反应器的混合与传递特性等)密切相关，也就是说基因型与环境共同决定了生物系统的表型特征。另一方面，生物过程具有高度非线性和时变性特征，难以用环境操作参数的检测与控制为目的的宏观动力学来表征其复杂的本体特征。既然以环境操作参数的检测与控制为目的的宏观动力学研究并不能真正代表生物细胞体复杂的本体特征，因而所开展的过程优化就可能成为无本之木、无水之源。有研究者提出应该结合发酵过程中参数相关的代谢特性，系统地分析细胞的代谢变化，强调细胞的生理状态与参数相关是生物反应器中物料、能量或信息传递、转换以及平衡作用的结果。随着系统生物学和合成生物学研究的深入，也有人提出环境组学研究，Klumpp等［2］开 展 “垂 直 研 究”(vertical approach)来补充组学(omics)“水平研究”(horizontal approach)的不足。因此，尽管其微观影响因素也许只是发生在基因、酶、细胞或反应器水平的某一个尺度上，但最终会在宏观过程中有所反映，这为研究生物反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供了线索。因此，张嗣良等［3］提出了生物反应器生物过程的多尺度问题，认为以细胞为主体的细胞大规模培养的生物反应过程呈现出基因分子尺度、细胞尺度与生物反应器尺度的网络结构，且不同尺度的网络间有着输入输出关系，存在着信息流、物质流与能量流，不同尺度的参数相关关系更能反映生物过程的本质特征，找到影响细胞代谢流的敏感参数是生物过程控制和优化的关键。而理想的生物反应器系统应该要尽可能对于不同尺度操作参数和状态参数进行检测和分析，从而有可能构建一种优化的外在环境，使微生物的基因表达及代谢调控最有利于某种目的产物的生物合成，最大限度地积累目的产物。以上表明了生物过程的工程科学问题，即由宏观动力学研究发展到基于生物过程信息处理的多尺度理论方法研究，由此来指导以生物反应器为核心的生物过程相关工程技术发展。

基于上述观点，科技部国家生化工程技术研究中心(上海)设计了一种以代谢流分析为核心的生物反应器系统，已由上海国强生化工程装备有限公司组织生产。该生物反应器系统包括各种用于细胞生理代谢特性检测的先进传感器、用于生物过程微观代谢流分析的传感反应器及控制系统、适用于细胞生理代谢参数相关分析的计算机软件包和用于发酵过程数据处理及远程分析的计算机互联网系统等。该系统能够尽可能多地获得生物加工过程各尺度的生物信息，然后基于多尺度参数相关原理，通过计算机软件的实时数据处理，在海量数据中找到以参数相关性特征为依据的过程优化关键参数，进而用来指导工艺操作、设备设计或菌种筛选改造，最终实现过程优化与放大。该系统先后成功地应用于青霉素、红霉素、鸟苷、金霉素、链霉素、黄霉素、泰乐霉素、克拉维酸、基因工程白蛋白、基因工程疟疾疫苗、基因工程可利霉素、重组植酸酶、头孢菌素C、辅酶Q和维生素B12等多种产品的生产过程优化，大幅提高了发酵单位的能力，其优化工艺一般可由几十升发酵罐直接放大到上百立方米的工业生产发酵罐。

2.2 先进在线仪表开发和应用

以代谢流分析为核心的生物反应器系统配备了先进的传感系统。除了具有pH、温度、搅拌转速、溶氧、转子流量计等常规检测控制参数外，还根据精确测定生物过程氧消耗速率(OUR)和CO2释放速率(CER)的需要配置了热质量流量计(进行进气流量的精确测定和控制，保证其不受进气压力的影响)、发酵液称量系统、尾气氧和CO2测量仪(尾气成分测定仪或过程尾气质谱分析仪)、置顶式硅油压力传感器。还可根据需要配置微观代谢流分析传感反应器及控制系统、原位活细胞浓度在线测定仪、细胞形态在线显微观测仪等在线传感器。根据测定得到的直接参数，通过用于细胞生理代谢参数相关分析的计算机软件包，可以计算得到CER、OUR和RQ等重要生理代谢状态参数。

过程尾气质谱分析仪主要用于尾气中O2、CO2和N2浓度测定。该质谱仪采用电子轰击离子源，来源于不同发酵罐的尾气经过在线预处理后，通过多通路旋转阀不断地输入电离室形成离子，利用带电粒子在电场中的运动规律，四极杆质量分析器将离子源产生的离子按其质荷比(质量和电荷的比，m/z)进行分离，测定离子质量-强度分布，得到化合物种类及其浓度信息，准确反映发酵尾气成分变化。测量结果可被输入到针对发酵过程设计的专用软件包，实现与其他发酵参数的相关分析。尾气质谱仪对相对分子质量300以内的挥发性气体成分都可以进行测定，因此还可根据发酵需要对乙醇、甲醇等小分子物质进行检测。该仪器目前已由上海舜宇恒平科学仪器有限公司实现国产化。

生物量是发酵过程重要参数。目前通常通过一些经典测定方法，如干质量、浊度等，进行离线测定而得到。原位活细胞浓度在线测定仪不但可以进行即时的在线测定，而且获得的是生物学意义更为丰富的活细胞浓度。这对于那些培养基中含有不溶固体物质的发酵过程尤为合适。活细胞测定仪原理是基于0.1～10 MHz频率范围的交变电场中，发酵液中细胞表面如细胞膜会发生非导电极化，使得有完整原生质膜的活细胞基本上像一个电容器(一般脂质原生质膜的非传导性本质使得电荷增长)，而死细胞、裂解细胞、细胞碎片、气泡和其他基质组分基本上不可极化。利用双电极施加上述频率范围交变电场，双电极之间的电容测量值依赖于细胞类型和细胞大小，并在一定范围内与活菌浓度成正比。原位活细胞浓度在线测定仪适用范围包括各种动植物细胞、酵母、细菌及藻类等。但对于那些需用酸碱作为目的产物中和剂的发酵过程不合适，因为发酵液中过大的离子强度会干扰电容的准确测定。

3 大型生物反应器设计与放大

3.1 生物过程及反应器放大

从实验室到工业生产特别是大规模的生产，都要解决生物过程反应装置的放大问题。原因是随着装置的放大，物料的流动、传热、传质等物理过程的影响因素和条件发生了变化。提高生物过程的放大效率、降低风险、实现工业过程与装置的高效率是生物过程放大的主要目标。

从二次世界大战时期青霉素实现工业化大规模生产开始，浸没培养方式使得搅拌通气式反应器被视为工业生物技术发展的主要标志。然而，生物过程的复杂性使得生物过程的放大技术及理论发展一直是生物技术学家们致力于解决的问题，受到化工过程放大的影响，生物反应器过程放大主要借鉴化学工程传统的放大方法，但是由于反应器内的流动、传递和反应过程具有典型的多尺度特征，导致工业大型反应器内的微观分子混合、流动、传递与反应的环境和状态远远偏离实验室小反应器，已经证明在满足几何相似和时间相似的条件下，不可能再满足化学相似的条件。即使在化工过程放大中仅依赖于全反应器平均值的经验关联式进行的放大都不能很好地解决过程放大所遇到的问题;而在生物过程放大中还涉及了复杂的生物代谢反应过程，受到环境条件的调控，相比化工过程更加复杂，存在更加复杂的多尺度特性。

20世纪60年代发展起来的数学模型方法是一种比较理想的过程放大方法，其提出的初衷是通过数学模型来描述化工过程中的反应及反应器内混合与传质过程来进行设备和工艺的设计，同时预测不同规模的反应工况并优化操作条件。这一技术的发展使化工过程放大理论得到了很大程度的充实，并且取得了很好的结果。与此同时也发展了多种用于描述生物过程的数学模型，基于数学模型实现生物过程的放大取得了一定的进展，同时也促进了生物反应工程学科的发展。

基于前述对于生物过程工程科学问题的认识和生物过程及反应器放大研究现状，笔者对生物过程及其反应器优化与放大形成了一条新的思路，即基于生物过程的高度复杂性，首先通过过多尺度参数相关与跨尺度观察研究方法从海量的生物过程信息中找到影响过程优化的关键敏感参数(或群)，然后以这些关键敏感参数为基础开展动力学研究(或建立过程数学模型)，实现生物过程及其反应器的有效放大。

3.2 计算流体力学及其在生物反应器设计与放大中的应用

近年来，随着计算机技术的迅速发展，计算数学、计算机科学、流体力学、科学可视化等多学科综合形成了计算流体力学研究(computational fluid dynamics，CFD)，为化工过程优化与放大进一步提供了依据，以生物过程研究为主体的生物反应器放大也开始运用CFD方法［4］。目前反应器内单相流的CFD模拟已较为成熟，并可结合实验测定装置如激光粒子测速仪(PIV)或激光多普勒测速仪(LDA)等实现模拟结果的验证［5］。然而气液两相及气液固三相流场模拟方法虽有应用但仍未十分成熟，因而对气液固多相的生物反应器放大无疑存在一定限制;另外对包含高度复杂生命系统的发酵过程，很难用一个有限参数的模型来描述预测不同规模的反应器工况下细胞的复杂代谢反应，因而还难以通过多相流动、传递和反应耦合过程与设备的机制模型及模拟技术实现过程放大。因此运用CFD方法与生物反应过程描述相结合来预测生物反应器过程并实现过程优化与放大是有困难的。但是从认识论的观点来看，反应器内复杂过程的机制是可以认识的，可以通过知识的积累和实践的检验逐步向正确的认识逼近。

以下针对通气搅拌生物反应器，分别以头孢菌素C、灰黄霉素工业规模发酵过程为研究对象，介绍CFD技术在生物反应器设计与放大中的应用。

3.2.1 基于混合限制的160 m3头孢菌素C发酵过程放大

头孢菌素C发酵从50 L放大到160 m3时，小试50 L发酵罐与160 m3生产发酵罐发酵过程参数进行比较发现明显的差异。主要表现小罐呼吸商(RQ)值偏低，大罐RQ值偏高。因此，从RQ值的比较反映出160 m3发酵罐中菌体对豆油的利用程度较50 L罐低。而生产罐100 h左右溶解氧(DO)严重不足。为了更清楚地了解发酵罐内混合与氧传递的情况，借助计算流体力学模拟方法对160 m3发酵罐内头孢菌素C发酵过程的流场分布进行了研究。流场分布模拟结果表明平叶涡轮桨产生明显的径向流，桨间流型互相干扰，底层搅拌桨距罐底的流场被破坏，形成迟滞区。并且气含率分层现象严重，底层桨产生气泛。因此，造成生产大罐豆油混合时间长、分布不均，表现为生产罐发酵过程RQ值偏高。在加长搅拌桨叶长度后，生产罐发酵单位提高了40%，达到了小试优化后工艺的水平，发酵水平有显著改善。可见由于大小反应器流场特性的差异，引起了头孢菌素C产生菌在碳代谢、宏观代谢流及头孢菌素C合成等方面的显著差异。

3.2.2 60 m3灰黄霉素搅拌发酵罐优化

灰黄霉素发酵液属于拟塑性非牛顿流体，在发酵过程中其非牛顿性不断发生变化，随发酵过程经历一个从低到高再从高到低的过程，在发酵100 h左右发酵液的非牛顿性最强。通过CFD模拟发现100 h时60 m3发酵罐底部桨没有起到气泡分散的作用，气体朝一边偏，导致气体不断合并，一股股地冲出液面，形成生产中观察到的上窜“气柱”。通过表观黏度分布看出，在罐体底部气体向一边偏的方向正是发酵液黏度不断降低的方向。由于发酵液为非牛顿性很强的拟塑性流体，黏度受剪切率控制，一为底层桨的搅拌引起的剪切应变率;另一为由通气管冲出的气体引起的剪切应变率，当两因素实力相当或后者较大时往往造成该区域速度场结构的紊乱，从而造成剪切应变率的不稳定分布和黏度的不均匀分布。在工业实际生产过程中，底部搅拌桨直径加大后的生产罐基本解决了发酵前期液面处气柱的产生及逃液问题，发酵后期供氧基本满足需要，生产变得稳定，实现了放大目标。

3.3 传统搅拌罐反应器改良

近年来发酵工业快速发展使发酵工程设备趋向大型化、高效化和自动化，高效节能的大型生物反应器装置的应用是降低生产成本不可或缺的关键技术。随着反应器规模的增加，传统搅拌反应器的搅拌及通气装置都在应用和研究中不断得到改进和创新。这时主要考虑的问题包括:气液传质性能、混合性能及剪切作用的大小，其中气液传质性能成为重点考虑的内容。

随着反应器规模的增加，传统的多层径流式搅拌桨变得不再适用。针对大型搅拌反应器内进行的好氧发酵过程，一般底层配备分散气体的较大直径径流桨以提高供氧，而上层多采用轴流搅拌，增加气体的混合时间并促进整体的混合，同时降低搅拌功耗。另外在气体分布装置上也出现了各种新的应用趋势，例如魏洪普等［6］提到射流式气体分布装置的应用，一方面可以大大提高气液传质比表面积，另外也可节省大量的搅拌功率消耗，是一种理想的气体分布装置，但这种装置形成的局部高剪切作用对剪切敏感性细胞的培养不能适用。

随着CFD模拟技术的发展，将CFD模拟引入搅拌通气反应器优化改造中的报道逐年增多。笔者所在课题组在工业规模反应器放大中即利用CFD模拟技术优化了用于头孢菌素C放大的搅拌组合［7］，另外还比较了不同规模反应器内搅拌桨形式对放大前后流场结构的影响［8］。通过CFD模拟的方法不仅可以得到不同桨形结构对传质混合的影响，而且可以定量计算传值系数在空间的分布［9］，并有利用CFD与细胞动力学整合、用于建模并预测操作条件对发酵过程影响的报道［10］。这将是反应器搅拌与通气设计的一个更加理性的技术手段。

4 微型生物反应器

4.1 微型生物反应器及其作用

微型生物反应器(microbioreactor，MBR)指的是容积在数百毫升以下的小型生物反应器(small-scale bioreactor)以及容积在100 mL以下的迷你反应器(miniature bioreactor)。微型生物反应器往往可同时进行几个甚至几十个平行的培养过程，因而具有一定高通量特性。目前MBR已经有效应用于菌种筛选过程中的菌种特性鉴别、微生物和动物细胞培养基及培养工艺快速优化，成为目前生物反应器重要发展趋势之一［11－12］。MBR的概念主要可以分为两类:一是自上而下，将传统的生物反应器缩小，并且集成和阵列化，以提供较多的过程信息和通量;二是自下而上，在传统的高通量装置(如摇瓶、微孔板)上配置过程检测的装置(如溶氧、pH检测)，以提供一定的过程信息。典型的MBR包括微流反应器、孔板式反应器、摇瓶式反应器、搅拌式反应器等，其工作容积分别为微升级、毫升级、十数毫升、数十到数百毫升。

在工业生物过程中，传统的高通量筛选技术一个重要限制因素是缺乏过程信息，不考虑生物过程变化和细胞代谢与所处环境的相互作用，只以最终效果来评判微生物菌种好坏，这往往导致经过高通量筛选得到的微生物菌种在工业生产上应用效果不佳。微型生物反应器将传统摇瓶、多孔板的高通量、低成本以及传统生物反应器的多信息、易控制等特性结合，既能够提供生物过程信息，又具有一定的高通量特性，可以用于高通量筛选所得菌株代谢特性快速鉴别和生物反应过程动态研究，弥补现有高通量筛选技术的不足，是连接菌种高通量筛选和工业规模应用的重要手段。利用MBR，高通量筛选和菌种性能评价可以分为以下3个过程［11］:①在微孔板或试管中大规模筛选上千个菌种;②在摇瓶或MBR中继续筛选上百个菌种;③在实验室生物反应器中对几十个菌种进行细致筛选。微型生物反应器显然是其中重要一环。

4.2 微型生物反应器结构组成

微型生物反应器系统主要包括检测、培养和控制等组成部分，具体如下。

4.2.1 微检测系统

为了能够获取生物过程信息，必须建立过程检测系统。生物反应器微型化的一个重要前提是检测传感器的微型化。常规的电化学传感器由于存在探头体积大、检测漂移等因素，无法满足阵列式微型反应装置的过程实时检测。基于光化学传感技术在生物过程中的应用，其无损、实时、动态过程监控使微生物反应器的平行检测变成可能。荧光传感器以灵敏度高、可采集信号丰富及使用方便等优点备受人们关注，近年来得到了迅速发展［13］。与过去基于电化学原理设计的传感器不同，光化学传感器是一种非接触式传感器技术(non-invasive sensor)，因此最大程度地减少了在线检测对生物过程状态的干扰，同时可以同步、实时进行。这些传感器本身具有良好的抗干扰特性，不受电磁干扰或传感器之间电信号相互干扰的影响。

荧光化学传感器是基于电磁波与分子之间的作用。用特定波长的激发光照射荧光化学物质，荧光化学物质发射光的特性(例如光强)与反应器中某种物质浓度(例如pH或溶氧)相关。将载有荧光化学物质的传感膜放置在反应器中，通过特定的光路和光电检测系统，即可实现反应器中某种物质浓度(例如pH或溶氧)的光化学检测。由于这种荧光化学传感器可以做得很小，因此在各种微型生物反应器中得到广泛应用。

在各种离子、温度及黏度的荧光分子传感器的设计中，可以采用测定发射光强度的方法，即发射光的光强度与所检测对象相关，通过检测发射光的光强度变化得到检测对象的值(例如pH)。然而这种方法具有一定的缺陷，表现在微环境测量时的荧光单元的浓度、光程以及激发光强度的漂移会引起错误的读出。由于浸析、光电漂白以及其他光功率漂移，同时强度的变化与光线的曲度形状、耦合、散射、背反射、传感器的光漂白、背景光等，根据荧光强度测量值来确定pH、DO等参数需要不断地进行校正。

基于检测发射光强度的荧光传感器在实际使用过程中存在一定局限性，另一种基于光寿命(lifetime)的荧光化学传感器得到了开发。这种传感器采用测定发射光寿命的方法，即发射光的寿命与所检测对象相关。由于光寿命与传感膜厚度无关，并且不会受到光源光强度、其他物质吸收或发射光的影响，因此，基于光寿命的荧光化学传感器的抗干扰能力和实用性较强，目前得到了广泛的应用［14］。

在实际设计中，荧光传感器主要分为两类，即在溶液中使用的均相荧光传感和易于重复使用且能进行气相传感的薄膜荧光传感器。均相荧光传感器因灵敏度高、选择性好，广泛应用于金属离子、阴离子和中性分子，特别是生物分子的检测和识别中。然而，使用某种荧光染料指示剂的均相荧光传感器非常容易污染待测体系(培养液)，同时只能一次性使用，其应用受到了极大的限制。将均相荧光传感器固定于基体表面制备成薄膜荧光传感器则基本上可以克服上述缺点，实现传感器的重复使用，减少污染。因此，近年来薄膜荧光传感器受到人们特别关注。薄膜荧光传感器测定的原理就是利用特定波长的激发光照射固定于生物反应器内壁上含有荧光染料指示剂的膜片(patch)上(即荧光传感器)，指示剂产生发射光，并被检测器检测到。

4.2.2 微培养体系

微型生物反应器的一个重要组成是培养容器。目前主要有3种方式来构建:①利用传统的高通量装置，例如微孔板、摇瓶等，然后装上pH、溶氧等微型过程检测装置来实现，例如在微孔板中加装挡板以及实时检测pH和溶氧的光化学传感器［8］。同时加装自动操作装置，实现自动化或半自动化高通量培养过程。②将传统生物反应器微小型化，并用光化学传感器替代传统的传感器，实现反应器的微型化。图1是一个18 mL工作体积的搅拌式微型生物反应器原型机图［15］，该微型生物反应器采用了上搅拌形式并安装有挡板，以保证供氧。pH和溶氧的光化学检测位于反应器侧面。传感器和装置(例如搅拌电机)的微型化是传统反应器微型化的一个重要基础。③对培养容器进行专门设计，以满足过程微型化和检测微型的要求。例如以聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)和(聚二甲硅氧烷，polydimethylsiloxane，PDMS)为材料，构建一个多层板的结构，然后将其整合成一个微型反应培养体系［12］，包括通气、搅拌以及pH和溶氧的检测。

图1 搅拌式微型生物反应器结构［15］Fig.1 Structure of stirred microbioreactor

4.2.3 微控制体系

与常规生物反应器相比，微型生物反应器的控制方式有比较大的不同，例如小雷诺数下的搅拌混合、加热控制、通过PDMS膜来进行气体交换、微环境下的流体力学以及利用微流泵和微型阀门来进行不同目的的液体操作等［12］。这些微操作技术的发展，是微型生物反应器研制的另一个重要基础。

5 动物细胞及组织工程反应器

5.1 动物细胞生物反应器进展

传统搅拌式动物细胞生物反应器最大体积已经达到25 m3，并且成为工业过程生产的一个标准选择。它具有符合卫生要求、批次成本低、重复使用等优势，但同时也要求复杂的员工操作培训，包括高劳动强度的清理、灭菌、GMP验证流程或者其他的常规流程。以上这些都增加了工业化过程的时间、成本和开发难度，延长了产品的上市时间。而对于处于研发期间或者中小生产规模的产品(100～200 L)，一次性生物反应器和某些袋式生物反应器提供了额外的选择。尽管近些年来各种类型的一次性生物反应器层出不穷，但是其工程特性的研究尚不完善，尤其是逐级放大流程的标准制定，还需要进行更深入的研究。

生物反应器设备的发展要适应生物医药产品研发和生产的需求，比如更短的工业化开发周期、生产的生物安全性、工业化生产的成本控制等。这使得生物反应器的发展除传统搅拌式动物细胞生物反应器外，根据用途不同而产生更多分支，其中包含更多个性化生物反应器。主要体现在如下几个方面:①微型生物反应器，主要代表为实验室小体积生物反应器优化系统，主要用于细胞菌株筛选、培养基优化和其他用途。这样的系统往往采用微孔板、微管、搅拌瓶或者摇瓶作为细胞培养的载体，同时配有各种过程参数检测设备，并可以实现在线高通量检测［16］。②装备复杂检测设备和控制设备的过程研究系统，主要用于实验室和中试研究中，系统往往含有多级生物反应器，与实验室微生物反应器系统有很大的不同，每个生物反应器都包含有完整的配件，比如搅拌桨、通气设备等，不仅如此，还包括活细胞在线检测设备、在线生化分析设备甚至在线显微镜等。通过详细研究细胞在每级生物反应器的培养数据，可以获得大量工程参数，为生物反应器逐级放大工艺提供依据，最终可缩短工业化生产所需的时间。③模拟工业模式的实验室台式生物反应器系统，这些生物反应器一般都由工业分布控制系统(DCS)控制，在系统中可以使用嵌入的模型和分析、监控、调试、控制工具等。这些实验室台式反应器易于操控，配以工业控制模块，可以模拟工业控制模式，测试模型以及用于流程优化等，达到优化工业控制过程的目的。④低成本生物反应器，主要是通过新型驱动和循环模式减少传统生物反应器的必须组件，降低采购设备的一次性投入。这种生物反应器的适用性较窄，往往仅针对某几种特定的产品，按照其工艺设计，可以去除生产流程中不需要的设备，对于控制成本有非常好的效果。在某些特定的情况下，不失为完整生物反应器外的另一种选择。⑤一次性生物反应器，种类非常多，包括膜生物反应器、波浪式袋生物反应器、搅拌式袋生物反应器、气体驱动袋生物反应器和摇动式袋生物反应器等［17］。近十年来，药物生产成本压力和制药行业模式的改变催生了一次性生物反应器在药物研发和生产中的快速发展，大量研究证明了中小规模体积的一次性生物反应器在药物研发过程中能够起到更高的效率。下面详细介绍一次性生物反应器。

5.2 一次性生物反应器

一次性生物反应器的体积从10 mL到2 m3不等，主要用于筛选试验、治疗抗原的生产(重组蛋白、抗体、次级代谢产物等)和病毒的生产(兽用和人用疫苗)。预先灭菌的培养容器是一次性生物反应器中最关键的部分，其制作材料必须为美国食品与药物管理局(FDA)批准的特殊材料，且仅为单次使用。不同类型的培养容器在设计、材料类型、体积、能量传递和功率输入等方面都可能有所不同。近年在对一次性生物反应器的研究中有3种驱动类型的生物反应器较为典型:摇动式生物反应器、搅拌式生物反应器和波浪混合式生物反应器，其中机械驱动类型的重要性越来越得到认可［18］。尽管工作原理和驱动设备各不相同，但是它们都能够提供良好的细胞生长环境，其最大细胞密度和蛋白产量已经达到了相同类型的玻璃和不锈钢生物反应器的水平。随着一次性生物反应器的发展，一次性生物反应器的培养规模和应用范围逐渐扩大，涉及培养各种工程细胞株，甚至干细胞，而反应器的类型特点将决定它们的应用和发展。

动物细胞一次性生物反应器类型的选择取决于一系列因素。培养工作特点(培养生物量和表达产物)和细胞株特性是最主要的因素。而生物反应器的最大培养体积和工程参数，包括流体参数、混合时间、剪切力分布等也同样很重要。比如，波浪混合式反应器的低剪切力特点更适合于某些对剪切力敏感的细胞株［19］。此外，法规需求(生物安全和GMP要求)、资金和运行费用也需要考虑。通常情况下，对于有不锈钢搅拌式生物反应器使用经验的企业来说，更容易采用搅拌式一次性生物反应器。但是种子制备阶段，低剪切力的波浪式反应器仍然占主导地位。

现阶段生产规模超过500 L以上的一次性生物反应器只有搅拌式的，它只装备了微泡或者环形通气管以及水平搅拌桨等基本设备，这限制了一次性生物反应器的适用范围。尽管如此，前景仍然乐观，采用振动混合的1 800 L袋式生物反应器和采用气体浮力混合的2 000 L袋式生物反应器产品也已经发布。一次性生物反应器具有显而易见的优点:操作简单、泛用性、更高的生物安全性、过程优化简单和一次性投入较低等，促进了其更深入的发展。

尽管动物细胞株改造和筛选技术以及动物细胞培养基筛选优化技术的深入研究已经使得抗体和蛋白的产量大幅提高，这似乎为一次性生物反应器的广泛应用铺平了道路。然而，由于传统搅拌式生物反应器在过去几十年中的稳定出色表现和其近乎无限扩大的生产体积，因此似乎也不可能在未来完全被一次性生物反应器所取代。

5.3 组织工程3D反应器

传统组织工程反应器往往采用的是静态培养，即单层细胞培养。这种体外组织构建中的细胞-支架共培养技术，就营养传输而言，一般不会受到营养限制，这是因为营养的被动扩散足以通过单层细胞10 μm左右的厚度。但当组织厚度超过100～200 μm时营养物质的扩散和代谢产物的排出就会受到明显限制，最终导致细胞无法在大段支架深部存活。显然，静态培养已无法满足大段支架与细胞共培养的要求。因此，改变传统培养方式，促进种子细胞在大段支架中心存活才能打破构建大段组织工程化这一瓶颈。

不同于传统的二维化单层细胞培养，三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture，TDCC)是指将具有三维结构的不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养能使细胞在模拟体内环境的生长环境中分化产生一定的三维组织特异性结构。TDCC作为体外单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁，显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年三维细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用。此外，由于三维细胞培养可获得与二维单层培养完全不同的结果，因此，在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面，三维细胞培养也得到了越来越广泛的应用。

就培养体系中的细胞总量而言［20］，以体外构建工程组织、器官的细胞三维培养一般远低于生物活性蛋白和疫苗生产的细胞培养规模。但以单位培养体积的细胞密度而言，细胞三维培养体系中的细胞密度一般远高于传统的细胞培养。在常规的细胞培养体系中，悬浮于培养基或固定于载体上的细胞处于均匀的流动相;在三维细胞培养体系中，固定于特定生物材料支架上的细胞处于非均匀的固定相。这些不同决定了现有的细胞培养装置不能直接用于细胞三维培养的目的。在提高培养装置的传质、传热、传气速率的同时又能充分兼顾流体动力对细胞生长和分化的不利影响是细胞三维培养对新的培养装置的基本要求。既能为细胞三维培养提供有利于细胞分化和组织型表达的物理参数，又能对细胞三维培养进行动态监测，是对细胞三维培养装置的理想化要求。要满足这些要求需要突破现有的生物反应器的设计模式。模拟微重力环境的旋转细胞培养系统为能基本满足细胞三维培养的新兴培养装置的设计提供了有益的借鉴［21］。

一种旋转式并实时透气的生物反应器系统为细胞和聚合物结构体提供了最理想的氧气条件和连续的力学刺激。由National Aeronautics and Space Administration(NASA)研究开发的一种旋转式生物反应器(rotating-wall vessel，RWV)［22］不但可以提供理想的供氧条件、较低的剪应力和振荡，而且还可以模拟微重力环境，在骨组织工程的研究中已经得到了广泛的应用。这些反应器系统虽然能够使支架表面的氧和营养物质充分混合，但是很难将培养液输送到支架内部。

旋转灌注式生物反应器作为一种新型的反应器［23］，兼具旋转壁式反应器和灌注型反应器的优点。该系统可使培养液流过支架内部相互连通的微管道，使黏附在微管道内的细胞得到充足的氧气和营养成分，使大段支架内代谢产物更容易排出，细胞基质分泌更多，细胞分布更均匀合理，细胞表型得以更充分的表达，种子细胞可达到远超过被动扩散的深度;同时，培养液流经微管道产生的对流和湍流会使细胞受到一定的剪应力，可加速成骨细胞碱性磷酸酶表达和矿化结节的形成，从而促进细胞增殖、分化和矿化基质的产生。可见，旋转灌注式生物反应器提供的动态培养不仅具有利于细胞生长的微环境，而且存在一定的应力刺激，可保证细胞在大段支架中心的存活，并促进细胞功能的发挥。

6 酶反应器

目前生物催化与转化的产品已经触及人类生活的方方面面，包括大宗化学品、精细化学品、食品、医药、农药、饲料添加剂等。酶反应器作为生物催化的反应装置，依据生物催化转化反应的特性而设计，是实现工业生物催化的关键设备。

与其他生物反应器不同，生物催化反应的介质体系和反应条件是非常多样化的，这要求相应的酶反应器必须量身定制。虽然单一水相介质是传统生物催化过程常用的介质体系，但是新一代工业生物催化的许多底物大多是人工合成的非天然底物，在水中的溶解度比较低，并且经常面临底物、产物的抑制问题，采用两相介质体系可以很好地解决这些问题。具有较高logP值(P是该物质在正辛醇与水相的分配系数)的水不溶性有机溶剂具有良好的生物相容性，可以用作底物的储库，与水相缓冲液构成液液两相体系，反应过程中随着水相底物的转化，有机相中的底物持续扩散、传递到水相，维持水相底物浓度相对恒定，从而实现低溶解度底物的高效转化［24］。离子液体(ILs)是另一类非常好的液相选择，其应用呈现日益扩大趋势［25］。对于水不溶性的液态底物，也经常选择高分子吸附树脂作为储存底物的另一相，通过树脂对底物、产物的吸附作用，解除抑制效应，实现高浓度底物的上载。对于单加氧酶催化的反应，O2是必需的，这样就进一步构成了液液气或固液气三相体系。酯酶、脂肪酶等可在很低水活度环境中发挥催化作用，因此可以采用低水活度介质体系，比如微水有机溶剂介质、逆胶束体系，或直接使用液态底物作为反应介质。此外，人们发现，超临界CO2也是一种比较出色的生物催化介质。近年来，气固两相反应体系也常见报道［26］。

对于单一介质体系，柱型反应器是一种非常好的反应器形式，剪切力小，可以有效避免催化剂的失活，并且很容易实现连续化操作，目前其最大规模的应用是葡萄糖异构化制备高果糖浆，年产量达到上千万吨。对于两相或多相反应介质体系，搅拌釜型反应器的应用比较广泛，其结构简单，可以实现多相复杂体系的高效混合。搅拌产生的剪切力以及液液两相界面是使催化剂失活的重要因素，因此采用中空纤维膜反应器可以有效地避免搅拌失活，催化剂被限制在中空纤维膜壁上或在壳层中循环，而底物溶解于水不溶性介质中，在管内循环，这样有效地避免酶与底物、产物的直接接触，避免了界面失活作用。

生物催化产品的分离、提取、纯化是产品生产的重要环节，据不完全统计，产品的后处理成本通常占到生产总成本的80%左右。充分利用产品的性质，将反应过程与产品分离过程耦合，开发反应分离耦合酶反应器，通过高性能不对称膜的截留、隔离作用［27］，结合蒸馏、结晶、电渗析、渗透蒸发、层析等产物分离提取的单元操作，可以以较低的成本实现产品的原位分离(in-situ product removal)。这样的酶反应器不仅可以简化产品的分离，而且可以很好地实现生产的连续化，是酶反应器设计的重要趋势。

操作的稳定性和连续化是酶反应器工业化应用的关键，随着工业生物催化的日益广泛应用，今后酶反应器的发展取决于以下几点:①新生物催化剂的开发及其固定化技术的长足进步。开发更高活性、高稳定性，具有优异机械操作性能的固定化酶/细胞催化剂，对于酶反应器的长期、稳定运转至关重要;②膜分离技术的不断发展和操作性能更优异的膜材料及组件开发。与有机膜相比，金属膜、陶瓷膜具有更好的操作性能，污染小，易清洗，预计将获得广泛应用;③反应分离耦合模式的深度开发及应用。拓展分离耦联模式酶反应器的形式，更好地节能减排，使生物催化过程更加绿色，充分体现生物催化的优势。

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