卵巢上皮癌细胞株OVCAR—3培养相关影响因素分析

洪澜 朱根海 王圣坦 蔡俊宏

[摘要]目的 探讨卵巢上皮癌细胞OVCAR-3培养的影响因素，提高培养的成功率。 方法 按培养条件分为：未滤菌加抗菌素组、滤菌加抗菌素组、滤菌不加抗菌素组及改良复苏组，取对数生长期的细胞裸鼠皮下种植，观察成瘤率并行组织学检查。 结果 未滤菌加抗菌素组，复苏培养5次，全部失败；滤菌加抗菌素组，复苏培养10次，全部成功；滤菌不加抗菌素组，复苏培养10次，失败4次，成功率60%；改良复苏组：复苏培养10次，全部成功。种植后2周出现瘤体，各组成瘤率100%，各组肿瘤组织学检查未见明显差异。 结论 无菌操作是OVCAR-3最重要的影响因素，滤菌及加用抗菌素是关键步骤。

[关键词] 细胞培养；卵巢上皮癌细胞株

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）05-28-03

卵巢上皮癌细胞培养是卵巢癌临床与基础研究的基本技术，其成功与否直接影响到卵巢癌研究的进程和质量。卵巢上皮癌细胞株种类较多，OVCAR-3是近年来使用比较多的卵巢上皮癌细胞株[1]，本研究通过对其培养成功和失败的总结，分析其影响因素，以期达到提高培养成功率的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和实验试剂 人卵巢上皮癌OVCAR3细胞株（American type culture Collection，ATCC）（Manassas， VA），胎牛血清、RPMI-1640培养液（Invitrogen，CA）。胰酶、二甲基亚砜（DMSO），青霉素和链霉素溶液。

1.1.2 实验仪器 二氧化碳培养箱（BB16UV，德国Heraeus公司），超净工作台（VS-1300L型，苏州安泰空气技术有限责任公司），倒置相差光学显微镜（IX71型，Olympus），恒温水浴锅（DZW-4型，金坛市恒丰仪器厂）。

1.1.3 雌性BALB/c裸鼠购自广东省实验动物中心；鼠龄4～6周，体重15 ～ 17 g；SPF（special pathogen free）级屏障系统内饲养，饲料及铺垫物均经过灭菌处理，所有进入实验室的人及各种用品均经过严格的微生物控制。

1.2 方法

1.2.1 在不同的条件下进行培养 （1）未滤菌加抗菌素组：所有试剂均未使用滤菌膜过滤，每10毫升培养液中加入20 μL浓度为200 U/mL的青霉素和链霉素溶液， 共复苏培养5次。（2）滤菌加抗菌素组：胎牛血清及培养液使用0.22μm及0.45μm滤菌膜过滤[2]，并加入20μL浓度为200 U/mL的抗菌素液，共复苏培养10次。（3）滤菌不加抗菌素组：胎牛血清使用0.22μm及0.45μm滤菌膜过滤，不加抗菌素液，共复苏培养10次。（4）改良复苏组：以上各组均采用传统方法复苏[3]，细胞复苏后加入10 mL培养液洗涤低速离心，弃上清液再加入培养液培养，本组指细胞复苏后直接加入培养液10 mL进行培养，第2天换液，共复苏培养10次。

1.2.2 具体方法 按以上方法复苏后隔两天换含10%胎牛血清的培养液，每次换液保留1/3原培养液，待细胞基本铺满瓶底80%左右进行传代，吸净培养液加入0.25%的胰酶溶液2 mL消化2 min使之脱壁游离，加入不含胎牛血清的培养液7 mL洗涤并低速离心，弃上清液，重复两次，再加入含10%胎牛血清的培养液6 mL吹打成细胞悬液，按1∶3的传代方式分置3个培养皿，每个补足培养液至10 mL，于37℃、5%CO2的条件下进行传代培养。细胞冻存方法： 配置冻存液，95%的原细胞生长用的新鲜培养液及5%的DMSO，细胞经胰酶消化、低速离心并弃上清液后用合适量的冻存液吹打成细胞悬液，细胞浓度为5×106/mL，按每份0.5 mL分装于冷冻管中，标记封口后先放入4℃冰箱10 min，转入-20℃放置30 min，再移置-80℃冰箱16～18 h或过夜，最后取出放入液氮罐中贮存。

1.2.3 皮下种植及肿瘤组织学检查[4] 取对数生长期的OVCAR-3 细胞以0.25%的胰酶消化后， 加入不含胎牛血清培养液制成细胞悬液，离心后重悬于PBS 溶液中，制备2×106 /0.1 mL细胞悬液，0.2 mL/只接种至裸小鼠的颈背部近腋窝处皮下，取瘤体行病理活检（HE染色），以上各组培养成功后各皮下种植5只。

2 结果

（1）未滤菌加抗菌素组：复苏培养5次，全部失败。（2）滤菌加抗菌素组：复苏培养10次，全部成功。（3）滤菌不加抗菌素组：复苏培養10次，失败4次。（4）改良复苏组：复苏培养10次，全部成功。

种植后2周出现瘤体，各组成瘤率100%，2个月解剖取瘤组织活检示肿瘤细胞形状大小不一，体积增大，核大深染，核分裂较多，各组肿瘤组织学检查未见明显差异。见图1～2。

3 讨论

肿瘤细胞培养受很多因素影响，包括细胞株的选择、冻存条件、化学药品的残留、物理损伤及各种污染控制等[5]，其中最重要的是污染控制，还要考虑的是细胞培养基外加成分如抗菌素等对细胞特性是否有影响。

3.1 培养液是否需要滤菌器除菌

滤过的主要目的是清除杂质及病原体，培养液配制过程都是无菌条件下进行，也没有杂质，生产过程中已经反复滤菌处理，理论上不需进一步过滤，但配制过程涉及很多环节，很难保证某些环节不受污染，本次实验结果也证实，培养液未经滤菌器处理的细胞培养均失败。一般采用0.45μm 及0.22μm滤菌器双层过滤。最终配制好的培养液包括胎牛血清均需过滤，过滤后分装冻存备用。很多使用者认为过滤繁琐，且说明书上并未注明必须过滤除菌，导致培养失败，因此滤菌器除菌是细胞培养非常重要的环节。

3.2 细胞复苏后是否需要洗涤细胞

传统方法细胞复苏后需要多次低速离心洗涤细胞以去除DMSO，但很多研究者认为DMSO在加入培养液稀释后浓度较低，对细胞造成的影响很小，况且离心可能会增加污染的机会并对对刚复苏的细胞造成一定的损伤，所以建议省略洗涤细胞这一步[6-7]。本组研究结果提示两种方法都可以，改良的方法更简单，操作更方便，改良培养法应该在第2天细胞贴壁后换培养液以清除残存的DMSO。

3.3 細胞培养液是否要加抗菌素或其他助生长剂

上皮细胞培养受诸多条件限制[8]，一般要加抗菌素或其他试剂促细胞生长[9]，肿瘤细胞抵抗力较强，生长很快，有研究者认为可以不加包括抗菌素在内的其他附加药物，该细胞株的出品地ATCC的培养说明中也没有建议加抗菌素，但不是每个实验室的条件都能控制到理想状态，细胞培养时不可避免受到各种病原体的污染[10]，本研究结果亦提示不加抗菌素培养失败率较高，或者细胞生长缓慢，因此加抗菌素有利于细胞培养。还有些作者认为加用层粘连蛋白 α2有利于肿瘤细胞的生长[11]，对于卵巢癌细胞株是否需要加入助生长剂目前尚未见报道，本研究认为只要没有病原体污染，细胞生长完全能满足研究的需要，不需加助生长剂。虽然卵巢上皮癌细胞比较容易培养，但仍需一定的技术条件[12]，其中就包括抗菌素的应用，使用的抗菌素为青霉素和链霉素混合溶液，使用浓度为200 U/mL，抗菌素的使用有两种方法，一种是和培养液配制时一起加入，分装备用，另一种是在培养时把抗菌素直接加入至培养皿中，因抗菌素在培养液中保存时间长可能会失效，所以目前多采用在培养皿中直接加入。

3.4 不同的培养条件对细胞特性是否有影响

本组研究还提示无论是传统的复苏方法还是改良的复苏方法，或是否加用抗菌素，只要细胞能正常传代，其接种裸鼠后成瘤率及细胞特性都没有变化，因此改良的复苏方法及加用抗菌素对细胞特性没有影响，可以作为肿瘤细胞的培养常规。

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（收稿日期：2013-01-14）