寡核苷酸类药物磷的定性定量分析

李保山??仲婕??朱德领??施明珠

[摘要]目的 用钼酸铵比色紫外分光光度法测定抗肝癌药物磷含量。 方法 用硝酸-高氯酸消解，钼酸铵比色紫外分光光度法测定药品中磷含量。用核磁共振31P-NMR谱，又进一步确定了本品寡核苷酸类化合物磷酸骨架上化学位移为55 ppm的PS键。 结果 分光光度法磷含量测定标准曲线为Y=0.13X+0.0227，r=0.9995，方法的精密度分别为：0.74%，重现性5.6%，回收率99.65%。 结论 钼酸铵比色紫外分光光度法测定寡核苷酸类抗肝癌药物和抗病毒药物中磷的含量，可操作性强，回收率较高，可为其他核酸类药物测定提供借鉴。31P-NMR谱进一步分析了P在硫代寡核苷酸药物中磷的存在形式。

[关键词]钼酸铵紫外分光光度法；寡核苷酸；磷

[中图分类号] O657.63 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）08-63-03

FLU和CT102为正在研制的硫代寡核苷酸类抗病毒药物、抗癌药物，均为含磷化合物，磷以磷氧键（PS）的形式存在。总磷量是一个固定的值，反映了寡核苷酸的纯度，从寡核苷酸中测得了总磷量，就可知样品中寡核苷酸的量，这就是用磷测核酸纯度的理论依据，所以磷含量是本品原料药的一个重要的质量控制指标，有必要准确定量，精确控制质量。

将有机磷酸化合物分解转化成无机磷酸盐的形式的方法一般有氧化分解法、磷钼蓝光度测定法[1-2]。氧化分解法操作虽简便但由于磷在高温灼烧之后对铂丝有腐蚀作用，使得铂丝逐渐破损变脆会影响结果的测定，现已少用[3]。我们应用现已有的仪器条件，将样品先消解，制成水溶液，用紫外分光光度法测定了本品中总磷的含量[4]。用核磁共振31P-NMR谱，又进一步确定了本品寡核苷酸类化合物磷酸骨架上化学位移为55ppm的PS键。

1 仪器与试药

紫外可见分光光度计，UV-2450，日本岛津公司。VARIAN INOVA 600 核磁共振仪，美国瓦里安公司。

磷酸根离子1000 mg/L，全国化工标准物质委员会标准物质研究开发中心，批号：GBW（E）080525，磷酸二氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠均为（优级纯，国药集团化学试剂有限分司生产）；浓硝酸，高氯酸，钼酸铵，对苯二酚，亚硫酸钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。

超纯水：18.2 MΩ/cm，Millipore公司试验用药物：寡核苷酸抗流感新药FLU，批号：20100512-1，20100706；寡核苷酸抗肝癌新药CT102；批号：20120626，20120817-2，军事医学科学院放射与辐射医学研究所九室。

2 测试条件

2.1 总磷含量（比色UV-VIS法）

钼酸铵溶液的制备：精密称取2.5 g钼酸铵，加30 mL水溶解，最后加37.5%的硫酸溶液20 mL，即得。

对苯二酚溶液的制备：精密称取对苯二酚0.5 g，置100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，再加浓硫酸一滴，即得。如产生颜色变化，则重配。

亚硫酸钠溶液的制备（20%）：精密称取5.0 g亚硫酸钠置25 mL容量瓶中溶解，即得（临用前配制）。

显色与测定：量取样品溶液15 mL置25 mL容量瓶中，加2.5 mL钼酸铵溶液，摇晃，放置30 s。再加对苯二酚溶液2.5 mL。再加2.5 mL 20%的亚硫酸钠溶液。最后加水至刻度。放置30 min，在730 nm处测吸收值。

2.2 核磁共振31P-NMR谱

溶剂：D2O；温度：环境温度；程序：延迟 1.000 s，暂停 47.0 度，捕获时间 0.266 s；扫描宽度：60060.1 Hz；扫描次数：30000 次。观测： P31，242.7908595 MHz；减 弱 波：H1，599.7718912 MHz；电源：46 dB 在采集时打开；在延迟时关闭 WALTZ-16 modulated。自动进样：15μg/mL。

3 结果与讨论

3.1 对照品溶液的制备和线性

对照品溶液的配制：精密称取0.1860 g磷酸二氢钾，置1000 mL容量瓶中，加水至刻度。

标准磷溶液的制备：分别量取1、2.5、5、10、15 mL置25 mL容量瓶中，不足15 mL的加水补足。分别加2.5 mL钼酸铵溶液，振摇，放置30 s。再分别加对苯二酚溶液2.5 mL，和20%的亚硫酸钠溶2.5 mL液，加水至刻度，放置30 min。用水做随行空白作为参比溶深夜，在730 nm处测其吸收值。以P浓度为横坐标，吸收值为综坐标，绘制标准曲线：Y=0.13X+0.0227，r=0.9995。

3.2 样品前处理

取干燥至恒重的样品43～44 mg，精密称定（43.5 mg），加水溶解，置50 mL容量瓶中，加水至刻度。取此溶液10 mL于圆底烧瓶中，加水10 mL、玻璃珠数粒和浓硝酸2 mL，缓缓加热浓缩至10 mL，冷却。再加浓硝酸5 mL，用调温电热套加热浓缩至10 mL，冷却。再加5 mL高氯酸，用调温电热套加热，待冒白烟后，于瓶口处放一漏斗，使其回流并回流浓缩直至溶液为3 mL，放置，待冷却，定量转移至100 mL容量瓶中，用水冲洗烧瓶数次，加水至刻度，即得样品溶液。

3.3 精密度试验

取磷酸二氢钾标准溶液（4.241 mg/L），按2.1项下方法显色后，重复测定5次，RSD为0.74%。

3.4 重现性试验

取同一批样品（CT102，批号20120626），5份，按3.2项下样品处理方法制得样品贮备液，按2.3项下显色并测定，样品中磷分别为8.345%、8.982%、8.273%、7.666%、8.415%，平均含量为8.34%，RSD=5.6% 。

3.5 回收率测定

取干燥至恒重的样品（CT102，批号20120626）43.5 mg，用水溶解，置50 mL容量瓶中，加水至刻度。分别取5 mL，7份，分别置于圆底烧瓶中，其中6份分别加入磷酸二氢钾标准溶液（C=0.186 mg/mL）2.0，2.0，2.5，2.5，3.0和3.0 mL，剩余一份不加标液。然后各加水至20 mL，玻璃珠数粒，浓硝酸2 mL，用调温电热套加热浓缩至10 mL，冷却。再加浓硝酸5 mL，用调温电热套加热浓缩至10 mL，冷却。再加5 mL高氯酸，用调温电热套加热，待冒白烟后，于瓶口处放一漏斗，使其回流并回流浓缩直至溶液为3 mL，放置，待冷却，定量转移至100 mL容量瓶中，用水冲洗净烧瓶数次，加水至刻度，即得回收率测定样品溶液。从样品溶液中各取10 mL置于25 mL容量瓶中，加2.5 mL钼酸铵溶液，震荡并放置30 s，再加2.5 mL对苯二酚溶液，最后加2.5 mL 20%的亚硫酸钠溶液，空白为不加对照品母液其余相同的溶液，放置30 min。用紫外可见分光光度计于730 nm处测其吸收值，依标准曲线计算磷的量，测定回收率。回收率结果如表2。

3.6 核磁共振31P-NMR谱P S键

用核磁共振31P-NMR谱，确定本品寡核苷酸类化合物磷酸骨架上化学位移为55 ppm的PS键。

图1 PS键核磁共振31P-NMR谱图

4 结论

用硝酸-高氯酸消解，钼酸铵比色紫外分光光度法测

定寡核苷酸类抗肝癌药物和抗病毒药物中磷的含量，简单易行，操作性强，结果稳定性好，回收率较高，可为其他核酸类药物测定提供借鉴。

本文钼酸铵比色紫外分光光度法[4]测定该药品中磷含量测定磷含量，两批CT102中磷含量为8.345%（20120626）和8.22%（20120817-2）；两批FLU中磷含量为8.89%（20100706）和8.982%（20100512-1）。

用核磁共振31P-NMR谱，确定了本品寡核苷酸类化合物磷酸骨架上化学位移为55 ppm的PS键。见图1。

[参考文献]

[1] 刘德富.卵磷脂中磷的分光光度法测定[J].松辽学刊（自然科学版），1998，10 （4）：41.

[2] 马金玲，张红军.分光光度法测定大豆磷脂中磷的含量[J].黑龙江医药科学，2000，23（1）：21.

[3] 陈世彬，史亚军，施俊辉，等.黄芩提取物亚微乳中磷含量的测定[J].成都中医药大学学报，2012，35（3）：70.

[4] 中华人民共和国国家标准.GB 11893-89水质总磷的测定钼酸铵分光光度法[S].1989.

（收稿日期：2013-03-25）