牛肉组织中硝基咪唑类药物残留检测方法研究

李小桥 武 煊 李玉平 苏亮

摘 要：建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定牛肉组织中地美硝唑（DMZ）、甲硝唑（MNZ）、洛硝达唑（RNZ）和替硝唑（TNZ）残留量的检测方法。样品经乙酸乙酯提取，正己烷除脂，PLS（亲水亲脂平衡柱）固相萃取柱净化后，以C18反相色谱柱为分析柱，0.1%甲酸水-乙腈为流动相，采用电喷雾电离源（ESI+），选择反应监测模式（SRM）进行检测。结果表明，4种硝基咪唑类药物响应值与其质量浓度在1.00～25.00ng/mL范围内线性良好，相关系数r2在0.998 6以上；在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下DMZ、 MNZ、 RNZ和TNZ回收率在64.4%～96.6%范围内，批内、批间变异系数小于15%；4种药物检测限（LOD）为0.1μg/kg，定量限（LOQ）为0.2μg/kg。方法满足于牛肉中上述单种或多种种硝基咪唑类药物残留检测。

关键词：UPLC-MS/MS；硝基咪唑类药物；牛肉；残留

中图分类号 S823 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）09-28-04

硝基咪唑类药物（nitroimidazoles）是一类具有5-硝基咪唑环结构的药物，包括甲硝唑（metronidazole，MNZ）、地美硝唑（dimetridazole，DMZ）、洛硝达唑（ronidazole，RNZ）和替硝唑（tinidazole，TNZ）等。该类药物主要用于治疗和预防厌氧菌引起的局部或系统感染，抑制厌氧菌的DNA合成，也用于抗滴虫和阿米巴原虫等。由于硝基咪唑类药物含有的硝基杂环类化合物具有细胞诱变性，从而导致此类药物有致癌作用和潜在的致畸作用[1-2]，因此硝基咪唑类药物在大多数国家为禁止使用或允许使用但必须严格监控的药物[3-4]。我国农业部235公告中[5]，地美硝唑、甲硝唑在动物中允许作治疗用，但不得在动物性食品中检出药物，洛硝达唑为禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出，但替硝唑没有明确的使用和残留限量规定，因此，在实际生产中替硝唑有可能代替其他硝基咪唑类药物应用于兽医临床，存在潜在的毒副作用。

硝基咪唑类药物的化学性质较不稳定，见光、遇热易分解，检测其在动物性食品中的残留较为困难。随着检测技术的发展，质谱法用于动物性食品中药物残留检测的报道越来越多，且能够对待检物进行确证，常用的有液相色谱质谱或串联质谱联用法（LC-MS/MS）[6-8]和气相色谱质谱（GC-MS）或串联质谱联用法（GC-MS/MS）[9]，由于气相色谱质谱法需要对极性、非挥发性、热不稳定的待检化合物进行衍生化，而且对衍生化条件要求十分严格，因此选用液质联用技术尤其是LC-MS/MS进行动物组织或产品中硝基咪唑类药物残留的检测具有较大优势。目前，国内外报道在猪组织、禽类组织、蜂蜜和饲料中硝基咪唑类药物残留检测方法较多，而对牛肉组织中硝基咪唑类药物LC-MS/MS检测法报道较少，本试验旨在建立一种简便、准确的测定牛肉中硝基咪唑类药物残留的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料 超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）：TSQ ULTRAL，美国Thermo Scientific公司；色谱柱：Thermo Gold C18色谱柱（150mm×4.6mm，2.1μm），美国Thermo Scientific公司；电子天平：AE250，瑞士Mettler公司；旋转蒸发仪：Laborota4000型，德国Heidolf公司；高速冷冻离心机：SIGMA 3K30，德国SIGMA公司；涡旋振荡仪：SIR4，德国IKA公司；空气摇床：KS260，德国IKA公司；氮吹仪：TTL-DCII型，北京同泰联科技发展公司。

地美硝唑、甲硝唑、洛硝达唑和替硝唑对照品：均购自德国Dr Ehrenstorfer公司（4℃冷藏保存）；甲醇、乙腈：色谱纯，均购自德国SIGMA公司；无水硫酸钠、正己烷、乙酸乙酯：分析纯，均购自重庆迈克公司；PLS（亲水亲脂平衡柱）固相萃取小柱：60mg/3mL，北京迪马科技有限公司。

牛肉样品：采集于重庆某超市生鲜部。

1.2 标准工作液配制 精确称取地美硝唑、甲硝唑、洛硝达唑和替硝唑对照品各10.0mg，用甲醇定容至50mL，制成浓度为200μg/mL的标准储备液，再精确量取1.0mL的标准储备液，定容至100mL，配成2μg/mL的标准工作液，标准工作液临用时再逐级稀释。

1.3 UPLC-MS/MS分析条件

1.3.1 液相条件 流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，梯度洗脱程序：0～1min，95%A线性变化至70%A；1～6min，保持70%A；6.0～6.1min，70%A线性变化至95%A；6.1～10min，保持95%A。流速：250μL/min；进样量：10μL。

1.3.2 质谱条件 监测模式：选择反应监测（SRM）模式；离子源：电喷雾电离源（ESI+）；喷雾电压4.5kV；蒸发气温度：150℃；毛细管温度：350℃；鞘气：30L/H，辅气：5L/H。4种硝基咪唑类药物选择反应监测模式下参数见表1。

1.4 样品处理

1.4.1 提取 称取（5.00±0.05）g牛肉于50mL塑料离心管，加入无水硫酸钠4g，再加入15mL乙酸乙酯，涡旋1min，振荡10min后，6 000r/min转速下离心5min，上清液转移至100mL鸡心瓶，残渣再用15mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液，于40℃水浴中旋转蒸发至干；用1mL甲醇、2mL 1%醋酸溶液和3mL正己烷溶解鸡心瓶中残留物，转移至50mL塑料离心管，重复以上操作一次，合并2次溶液，涡旋振荡2min，3 000r/min转速下离心5min，弃掉正己烷层，下层溶液中再加入6mL正己烷重复除脂一次，最后在下层溶液中加入6mL去离子水混匀，备用。

1.4.2 净化 依次用3mL甲醇和3mL水活化SPE小柱，将上述备用液全部转移上柱，流速不超过1mL/min，再用3mL水和2%甲醇溶液淋洗SPE小柱，挤干，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃下氮气吹干，1mL流动相（5%乙腈-0.1%甲酸溶液）定容，取10μL上超高效液相色谱-串联质谱仪进行分析。

2 结果与分析

2.1 提取与净化条件优化 硝基咪唑类药物见光、遇热易分解，整个试验过程要求在避光、较低温度下快速完成。对于动物组织中硝基咪唑类药物残留而言，常用的提取溶剂有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲苯、盐酸等[10-11]。由于二氯甲烷和甲苯有较强的毒性，本试验选择乙腈和乙酸乙酯进行了比较，二者提取回收率相当，但是相对于乙酸乙酯，乙腈提取动物组织时会提取更多极性基质[10-11]，且乙腈提取液在旋转蒸发过程中容易沸腾，操作较难控制，而乙酸乙酯沸点较低，提取液在较低温度下也能快速蒸发至干，因此本试验选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

硝基咪唑类药物在酸性环境下呈离子状态，易容于水溶液，而在碱性环境下呈分子状态，易溶于有机溶剂[12]，因此其净化过程可以选择液液萃取除脂，本试验选择醋酸溶液和甲醇复溶鸡心瓶残留物，再用正己烷除脂；另外，本试验过程中还筛选了SCX强阳离子交换柱、PLS亲水亲酯平衡柱和C18等固相萃取柱进行净化，实验结果发现使用SCX柱时，地美硝唑、甲硝唑和洛硝达唑回收率只能达到40%～50%，而C18柱对甲硝唑保留效果也不太理想，平均回收率不到60%，但是PLS柱能提高甲硝唑平均回收率到70%左右，其它硝基咪唑类药物均能达到80%～95%，因此本试验选取PLS亲水亲酯平衡柱进行净化。试验还对4种药物在样品中基质效应进行了研究，分别向空白样品基质溶液和流动相中添加4种混合标准溶液，制成相同浓度样品各5份，上机进行检测，分别比较4种药物的响应值，结果表明，在两种基质中差异不明显，因此可以忽略基质效应对实验结果的影响。

2.2 检测条件的优化 试验选择甲醇-甲酸水体系和乙腈-甲酸水体系作为流动相进行比较，结果发现，使用甲醇-甲酸水体系时，在Thermo Gold C18色谱柱上，4种硝基咪唑类药物完全不能分开，后者能完全分离4种目标化合物（见图1），因此本方法选择乙腈-甲酸水作为流动相。

DMZ、MNZ、RNZ和TNZ化合物在ESI+模式下响应很高，都以[M+H]+形式分别形成其质子化分子离子。再对其质子分子离子进行二级质谱扫描，结果表明，对于DMZ，分子离子电离失去NO2得到其主要离子碎片m/z=96.2；MNZ分子离子电离失去CH2CHOH得到其主要离子碎片m/z=128.1；RNZ失去HOCONH2得到m/z=140.2主要离子碎片；TNZ分子离子电离丢失5-硝基咪唑环得到m/z=121.1主要离子碎片（见表1）。最后对4种药物的8个离子对在SRM选择离子监测模式下进行优化，选择响应值最高时的碰撞能和透镜电压（见表1）。

2.3 标准曲线、检测限与定量限

2.3.1 标准曲线 将1.2中2μg/mL的标准工作液用流动相逐级稀释成浓度为1、2、5、10、20和25μg/L，在1.3 UPLC-MS/MS分析条件下测定，以各种药物特征离子质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，制得标准曲线。结果表明，4种硝基咪唑药物在1.00～25.00μg/L范围内线性关系良好，线性方程、相关系数（见表2）。

2.3.2 检测限与定量限 采用在空白样品中添加4种硝基咪唑类药物的方法，依据特征离子色谱峰信噪比S/N>3为方法检测限（LOD），S/N>10为方法定量限（LOQ），测得4种硝基咪唑类药物检测限为0.1μg/kg，定量限为0.2μg/kg。

2.4 准确度和精密度 在空白牛肉中加入由2μg/mL的标准工作液稀释成10、50和100μg/L的工作液各100μL（添加水平相当于0.2、1、2μg/kg），按1.4进行前处理，1.3条件进行检测，对每个加标水平做5个平行试验，重复3次，计算回收率和批内、批间变异系数，分别考察方法的准确度和精密度。

结果表明，在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下DMZ平均回收率分别是84.9%、91.2%和90.1%，MNZ平均回收率分别是67.5%、73.8%和75.5%，RNZ平均回收率分别是81.5%、84.0%和85.0%、TNZ平均回收率分别是94.2%、93.1%和94.7%，批内、批间变异系数小于15%，说明本方法准确度和精密度较高，满足于牛肉中硝基咪唑类药物残留检测要求。回收率结果见表3。

3 结论

本文建立了牛肉中地美硝唑（DMZ）、甲硝唑（MNZ）、洛硝达唑（RNZ）和替硝唑（TNZ）的超高效液相色谱-串联质谱法残留检测方法。样品经乙酸乙酯提取，正己烷除脂，PLS（亲水亲脂平衡柱）固相萃取柱净化，采用电喷雾电离源（ESI+），选择反应监测模式（SRM）进行检测。4种硝基咪唑类药物在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下的回收率在64.4%～96.6%范围内，批内、批间变异系数小于15%，检测限（LOD）为0.1μg/kg，定量限（LOQ）为0.2μg/kg，结果表明该方法稳定可行、灵敏度高，且分析过程简单快速，适用于牛肉中硝基咪唑类药物残留检测。

参考文献

[1]汪纪仓，王大菊，林霖，等. 硝基咪唑类药物残留检测方法研究进展[J]. 中国兽药杂志，2007，41（8）：31-33.

[2]沈建忠，项新华，张跃，等. 家禽肌肉组织中硝基咪唑类药物高效液相色谱检测法研究[J]. 中国农业科学，2003，36（6）：700-703.

[3]DOMNIQUE H P，BERNARD D，MICHEL L. Determination of four nitrioinidzole residuces in pourltry meat by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A，2000，882：89-98.