复发性流产与蜕膜组织中妊娠相关血浆蛋白A的关系研究

杨 君，王慧玲，华方方

复发性流产是指连续2次及以上的自然流产，是妊娠期妇女的常见并发症之一[1]。目前关于复发性流产的病因尚不完全清楚，约80%的流产者不存在生殖道感染、解剖、内分泌、遗传和自身免疫功能异常等病因[2]。妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)是由胎盘合体滋养层细胞和蜕膜细胞合成的母体血浆糖蛋白，研究显示其在早期配子的发育、受精卵的着床、妊娠的维持以及胎儿和胎盘的生长发育等方面均发挥重要作用[3]。其表达水平随着孕周的增加而增高，笔者在临床工作中发现PAPP-A水平在复发性流产孕妇蜕膜组织中的表达水平低于正常孕妇，本研究即探讨了蜕膜组织中PAPP-A水平与复发性流产之间的关系，现报道如下。

1　资料与方法

1.1临床资料病例入选标准：(1)患者染色体检查正常，无家族性遗传病史，家族中未出现过自然流产者；(2)患者生殖道感染检测呈阴性；(3)抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体及抗子宫内膜抗体检查均为阴性；(4)无自身免疫性疾病、内分泌疾病等；(5)无心脑血管疾病及其他传染性疾病病史；(6)配偶生殖系统和精液功能正常；(7)无吸烟、酗酒等不良生活习惯。选择2010年6月—2012年6月我院收治的复发性流产孕妇39例作为复发性流产组(RSA组)，年龄27～41岁，平均(33.1±5.4)岁；孕期5～7周，平均(6.1±0.8)周。选择同时期在我院进行人工流产的健康早孕妇女30例作为对照组，年龄23～40岁，平均(32.1±5.2)岁；孕期为5～8周，平均(6.5±0.9)周。两组受试者的年龄、孕周间具有可比性(t=0.143、0.217,P>0.05)。

1.2实验材料与仪器蜕膜组织均通过负压吸引术获得，于液氮中保存使用；Trizol购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自大连宝生物；SYBY Green MiX 购自罗氏生物；96孔板购自Applied Biosystems；小鼠抗人PAPP-A单克隆抗体购自美国Abcam公司；羊抗鼠二抗购自Santa-cruz公司；DAB显色液购自北京中杉生物技术有限公司；苏木精购自北京中杉生物技术有限公司；国产分析纯试剂；Real-time PCR扩增仪购自Applied Biosystems；LEICA RM2245石蜡切片机购自莱卡上海分公司；OLYMPUS BX5l显微镜购自日本奥林巴斯。

1.3实验方法

1.3.1荧光定量PCR(RT-PCR)分析PAPP-A mRNA水平将蜕膜组织从液氮中取出，置于1 ml Trizol试剂中，匀浆后加入200 μl的氯仿，振荡混匀后冰上放置5 min，12 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心15 min，吸取澄清部分加入等体积异丙醇中，混匀后冰上静置10 min，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，向离心管中加入1 ml预冷的75%乙醇溶液，轻轻振荡5下后8 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的溶液溶解，定量后采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为RT-PCR的模板。

PAPP-A引物，上游：5′-CTACTTGGATGTTAATGAGC-3′；下游：5′-TCCTGCCAACTCCTCCTCTG-3′。Actin作为内参，上游：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3′；下游：5′-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3′，由上海英俊生物公司合成。引物合成后稀释为10 μM。反应体系如下：2×SYBR®Premix ExTaqTM 10 μl，上游引物和下游引物各0.6 μl，cDNA模板1∶100稀释后取8.8 μl，总体积20 μl。按比例配制上述反应液后分装于96孔PCR板，每孔20 μl，然后以1 000 r/min离心2 min。PCR反应条件如下：预变性：95 ℃,30 s；变性：95 ℃,3 s；退火延伸：60 ℃,30 s；构建溶解曲线。表达量的计算采用ΔΔt模式。

1.3.2免疫组化分析PAPP-A水平将RSA组和对照组蜕膜组织用石蜡包被，切成5 μm厚的切片，贴于载玻片上进行脱蜡处理，结束后用磷酸盐吐温(PBST)缓冲液冲洗3次，用3%过氧化氢-甲醇液浸泡除去内源性的过氧化氢酶，PBST缓冲液冲洗3次后将玻片置于柠檬酸缓冲液中，微波加热进行抗原修复，冷却至室温后PBST缓冲液冲洗3次，用10%的山羊血清室温封闭1 h，然后用10%山羊血清稀释的一抗工作液4 ℃孵育过夜。次日在室温回温1 h后用PBST缓冲液冲洗3次，用二抗工作液室温孵育30 min,PBST缓冲液冲洗3次后DAB显色2～10 min，边显色边观察，着色后用自来水冲洗掉显色液，苏木精复染30 s，然后梯度乙醇脱水并用中性树脂封固。同时设立阴性和阳性对照。阳性评定标准:所有切片均采用Motic Med 6.0数码医学图像系统分析。每张切片随机选取10个视野，放大400倍，分析阳性细胞占总细胞数的比例，分为4个等级，阴性(-)：阳性细胞数<5%；弱阳性(+)：阳性细胞数5%～25%；中等阳性(++)：阳性细胞数26%～50%；强阳性(+++)：阳性细胞数>50%。并采用Motic Med 6.0 数码医学图像系统对标本进行定量分析。

2　结果

2.1RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP-A mRNA水平比较从蜕膜组织中提取的RNA经紫外线分析，光密度(OD)260/OD280为1.9～2.0，说明RNA纯度较高，未受到DNA和蛋白质污染。并采用反转录试剂盒反转录为cDNA，作为RT-PCR的模板。RSA组蜕膜组织中PAPP-A mRNA水平较对照组下降，差异有统计学意义(t=3.152,P<0.05，见图1)。

图1　RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP-A mRNA水平比较

Figure1Comparison of PAPP-A mRNA between RSA group and control group in basal deciduas tissues

2.2RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP-A水平比较PAPP-A表达于蜕膜细胞的胞质中(见图2A)。两组PAPP-A表达程度间差异有统计学意义(u=4.995，P=0.000),其中RSA组PAPP-A表达以强阳性为主，对照组主要以弱阳性为主(P<0.05，见表1)。对RSA组和对照组标本进行定量分析显示，RSA组PAPP-A表达水平较对照组下降(t=2.591，P<0.05，见图2B)。

2.3PAPP-A蛋白与复发性流产的关系以PAPP-A水平、年龄、孕周为自变量，以是否发生复发性流产为因变量进行Logistic回归分析，结果显示PAPP-A水平是导致复发性流产的危险因素之一〔b=1.722，OR=5.596，95%可信区间(2.406，13.017)，P=0.004〕。Hosmer-Lemeshow拟合优度检验结果显示PAPP-A水平对复发性流产的预测具有较好的校准度(χ2=3.158，P<0.05)。

表1RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP-A的表达程度比较

Table1Comparison of PAPP-A protein in RSA group and control group in basal deciduas tissues

组别例数-++++++对照组30219* 8 1 RSA组390 7 1121*

注：与组内其他表达程度比较，*P<0.05

注：A为PAPP-A的组织分布，B为PAPP-A的水平比较

图2RSA组和对照组蜕膜组织中PAPP-A的组织分布及水平比较

Figure2Comparison of PAPP-A protein location and level between RSA group and control group in basal deciduas tissues

3　讨论

复发性流产占妊娠总数的1%，给孕妇心理和身体造成了极大的损伤，目前已经成为临床研究的焦点[4]。但复发性流产的发病机制比较复杂，包括染色体异常[5]、内分泌异常[6]、免疫功能异常[7]、生殖器异常、感染因素[8]、全身性疾病、创伤刺激、不良生活习惯及环境因素等。但是约80%的复发性流产没有明确的病因[9]。近年来，随着临床研究的不断深入，发现PAPP-A在复发性流产孕妇中表达异常，因此本研究探讨了其与复发性流产之间的关系，旨在为临床诊断复发性流产提供一定的参考价值。

PAPP-A是与妊娠密切相关的一类大分子糖蛋白，近年来，研究显示其在早期胚胎发育、受精卵着床、妊娠期维持、胎儿和胎盘生长以及发育过程中发挥重要作用[10]。PAPP-A主要由胎盘滋养层合体细胞和蜕膜细胞产生，然后分泌入血，从妊娠后第5周起可在孕妇血清中检测到，并随着孕周的增加其水平逐渐升高，到妊娠末期达到最高峰，产后水平逐渐下降[11]。目前PAPP-A已成为临床早孕诊断和胎儿健康程度的主要监测指标。笔者在长期临床研究中发现，复发性流产孕妇血清中PAPP-A水平明显低于正常孕妇，这一结果跟目前部分报道一致[12]。

本研究显示，与对照组比较，复发性流产孕妇蜕膜组织中PAPP-A mRNA的水平明显下降；为了进一步分析PAPP-A水平，采用免疫组化的方法分析了蜕膜组织中PAPP-A的表达变化，结果显示复发性流产孕妇蜕膜组织中PAPP-A水平明显低于对照组，蜕膜组织中PAPP-A的表达下调导致了入血的PAPP-A水平下降，所以表现为复发性流产孕妇血清中PAPP-A水平低于对照组孕妇。进一步行Logistic回归分析显示PAPP-A水平下调是导致复发性流产的危险因素，提示其在复发性流产诊断中具有较好的准确性。

综上所述，PAPP-A在复发性流产蜕膜组织中表达水平明显下调，其下调是导致发生复发性流产的原因之一。

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