促红细胞生成素在非小细胞肺癌组织的表达及其与新生血管形成的关系研究

俞婷婷，张 焕，张 涛，单 莉，韩志刚

恶性肿瘤患者在治疗前后均有较高的贫血发生率，既往研究认为重组人促红细胞生成素(rH-EPO)治疗肿瘤相关的贫血可以减少患者输血、避免输血感染、改善患者生活质量；但近年研究发现，rH-EPO有可能直接或间接导致肿瘤细胞生长而促进疾病进展，且与促红细胞生成素(EPO)的促血管生成作用有关[1]。EPO可以调节肿瘤细胞的生长发育，引起恶性肿瘤新生血管形成，而新生血管基底膜不完整，肿瘤细胞可通过，与成熟正常毛细血管相比，新生血管更易接受肿瘤细胞，从而成为肿瘤细胞的转移途径[2]。本研究通过检测非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EPO的表达，探讨其与新生血管形成的关系，为临床更好地应用rH-EPO治疗NSCLC相关的贫血提供参考。

1　资料与方法

1.1一般资料选择新疆医科大学附属肿瘤医院2010年1—9月收治的经病理确诊且术后病理蜡块保存完好的NSCLC患者58例，术前均未接受过放疗或化疗；血红蛋白、肝肾功能、心电图检查正常，无其他恶性肿瘤病史，无心脑血管疾病及其他肺部疾病。58例患者中男37例，女21例；年龄36～75岁，平均54.7岁；鳞癌26例，腺癌32例；pTNM分期(2009 IASLC国际肺癌分期第7版)：Ⅰ期16例，Ⅱ期18例，Ⅲ期24例；高分化8例，中分化31例，低分化19例；淋巴结转移31例，无淋巴结转移27例。收集上述患者术后肺癌组织蜡块作为观察组，以距离癌组织边缘5 cm以外的非肿瘤性肺组织作为癌旁对照组。

选择新疆医科大学附属肿瘤医院同期收治的经病理确诊且术后病理蜡块保存完好的肺良性病变患者45例，其中男30例，女15例；年龄24～68岁，平均53.4岁；肺结核23例，坏死性上皮肉芽肿性炎10例，肺炎4例，支气管扩张2例，孤立性纤维腺瘤2例，肺大泡、血管畸形、硬化性血管瘤及支气管肺隔离症各1例；有吸烟史22例，无吸烟史23例。收集上述患者术后良性病变肺组织蜡块作为良性病变对照组。

1.2主要试剂兔抗人EPO多克隆抗体(H-162)购自美国Santa Cruz公司，兔抗人CD34单克隆抗体、兔抗人内皮素多克隆抗体、兔抗人FV Ⅲ相关抗原多克隆抗体、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学所有蜡块组织均经甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm切片，连续4张，选取其中1张复核病理诊断。60 ℃恒温箱烘烤20 min，脱蜡水化；3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，修复抗原；滴加一抗，4 ℃冰箱过夜；滴加二抗，冲洗后DAB染色；苏木精复染、脱水、封片；以磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)代替一抗作为阴性对照，以试剂生产公司提供的切片作为阳性对照。

1.4结果判定标准采用盲法，由2名病理科主治医生分别于光镜下观察，遇有分歧则通过协商决定。(1)EPO：主要表达于胞质，以胞质和(或)胞膜出现棕色颗粒为阳性表达，同时观察5个低倍视野(×200)，分别计数100个细胞，以其中阳性细胞数<5个为阴性，≥5个为阳性。(2)微血管密度(MVD)：在低倍镜下(×100)寻找整张切片中富含血管组织的“热点区”(hot port)，即棕黄染色密度最高的区域；在高倍镜下(×400)计数其血管数目，采用weidner评价标准：以CD34染色为棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇记为1条独立的血管，不以是否形成明显管腔、腔内有无红细胞存在为判断标准。每张切片选择3个高倍视野进行观察，计算MVD，取平均值。

2　结果

2.1EPO的表达观察组EPO主要表达于胞质，呈颗粒状，弥漫性分布(见图1A)，阳性表达率为63.8%(37/58)；癌旁对照组EPO主要表达于胞质，呈颗粒状(见图1B)，阳性表达率为19.0%(11/58)；良性病变对照组EPO多呈阴性着色，部分间质细胞可见弱着色，阳性表达率为8.9%(4/45)。3组EPO阳性表达率比较，差异有统计学意义(χ2=42.303，P=0.000)，其中观察组高于癌旁对照组(χ2=40.121，P=0.000)和良性病变对照组(χ2=40.343，P=0.000)，而癌旁对照组与良性病变对照组比较，差异无统计学意义(χ2=0.846，P=0.150)。

2.2EPO阳性表达与患者临床特征的关系不同性别、年龄、pTNM分期、病理类型、分化程度及是否吸烟、有无淋巴结转移的NSCLC患者EPO表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.3MVD3组CD34染色的微血管分布均匀，血管壁完整，形态较规整(见图2)。观察组MVD为(25.72±5.50)，癌旁对照组为(12.43±3.38)，良性病变对照组为(10.33±2.88)，3组MVD比较，差异有统计学意义(F=219.14，P=0.000)，其中观察组高于癌旁对照组(q=24.30，P<0.01)和良性病变对照组(q=26.31，P<0.01)，而癌旁对照组与良性病变对照组比较，差异无统计学意义(q=3.59，P=0.134)。

2.4EPO表达与MVD的关系观察组中EPO阳性表达者MVD为(26.14±5.26)，大于EPO阴性表达者的(15.97±8.29)，差异有统计学意义(t=5.34，P=0.001)。

注：A为非小细胞肺癌组织，B为癌旁组织

图1EPO在非小细胞肺癌组织及癌旁组织的表达(免疫组织化学，×100)

Figure1Expression of EPO in NSCLC tissues and adjacent tissues

表1EPO阳性表达与患者临床特征的关系

Table1Relationship of positive expression of EPO and patients′ characteristics

临床特征例数EPO阳性 阴性χ2值P值性别0.0510.822 男372413 女21138年龄(岁)1.4840.223 ≥6031229 <60271512吸烟史0.0330.855 有352213 无23158pTNM分期1.8970.387 Ⅰ期1688 Ⅱ期18126 Ⅲ期24177病理类型0.1040.789 腺癌322111 鳞癌261610分化程度0.8420.656 高844 中312011 低19136淋巴结转移1.4840.223 有31229 无271512

注：EPO=促红细胞生成素

注：A为非小细胞肺癌组织，B为肺良性病变组织

图2非小细胞肺癌组织及肺良性病变组织中的新生微血管情况(CD34染色，×100)

Figure2Newborn microvascular in NSCLC tissues and benign lesions tissues of lung

3　讨论

近年来，随着相关领域研究的不断进展，人们对EPO的认识产生了一次革命性的飞跃。EPO是一种内源性促血管生成因子[2-4]，其自分泌/旁分泌通路可以抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞凋亡，促进肿瘤血管形成及增殖分化，抑制肿瘤细胞凋亡，从而加速肿瘤细胞生长。EPO与肿瘤细胞增殖、抑制凋亡过程及肿瘤细胞对放化疗的敏感度有关，参与了肿瘤的生长、浸润、转移、耐药等过程。

本研究采用免疫组织化学法检测EPO在癌组织、癌旁组织及肺良性病变组织中的表达，分析其阳性表达与患者临床特征间的关系；采用CD34染色以观察癌组织、癌旁组织及肺良性病变组织MVD，进而探讨EPO表达与MVD间的关系，以期为NSCLC的临床诊断和治疗提供参考。本研究结果显示，观察组EPO阳性表达率高于癌旁对照组和良性病变对照组，EPO多表达于NSCLC癌细胞胞质和(或)胞膜，以阳性或强阳性表达为主，呈颗粒状，弥漫性分布。提示EPO可能参与了NSCLC的发生过程，可将EPO的阳性表达作为NSCLC的辅助性诊断指标。

通过分析EPO阳性表达与患者临床特征间的关系发现，不同性别、年龄、pTNM分期、病理类型、分化程度及是否吸烟、有无淋巴结转移的NSCLC患者EPO表达阳性率均无明显差异，与Ribatti等[5]报道不一致，分析其原因可能与EPO在不同肿瘤中阳性表达有差异有关。EPO阳性表达可促进肿瘤新生血管形成，本研究结果显示，EPO表达阳性者MVD明显高于EPO表达阴性者，与文献报道一致[6-8]。因此，在NSCLC治疗过程中应用EPO治疗肿瘤相关的贫血时要考虑患者的获益及风险。

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3Yoon D，Agarwal N，Prchal JT.Does erythropoietin promote tumor growth？[J].Clin Cancer Res，2008，14(6)：1920.

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4周成芳，周弟弥.促红细胞生成素对脑出血后大鼠血管内皮生长因子的影响[J].海南医学院学报，2011，17(11)：1449-1451.

6Doleschel D，Mundigl O，Wessner A，et al.Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts[J].J Nucl Med，2012，53(2)：304-311.

7韩志刚，俞婷婷，单利.促红细胞生成素及其受体在非小细胞肺癌中的表达及其与微血管密度的相关性[J].中华肿瘤杂志，2012，34(8)：605-608.

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