双阴性T细胞的研究进展

刘晗 张金巧

近年来，免疫调节细胞逐渐成为众专家学者研究的热点之一，其中αβTCR+CD3+CD4－CD8－T细胞(双阴性 T细胞，DNT细胞)因其独特的免疫抑制作用，越来越受到研究学者们的重视，DNT细胞在体外经过非己抗原刺激后可以特异性抑制同种同源CD4+和CD8+T细胞的增殖，将DNT细胞回输后能延长小鼠同种异基因移植皮肤的存活［1］，野生型C57BL/6小鼠的DNT细胞在接受大鼠抗原(脾细胞)刺激后表达B220和CD25，此B220－CD25－DNT细胞可通过穿孔素/颗粒酶途径溶解同基因的B细胞和T细胞［2］。为方便今后对DNT细胞的研究，本文将对DNT细胞作如下综述。

1 外周血中有DNT存在

在正常小鼠外周淋巴组织中，大部分αβTCR+T细胞都表达CD4分子或CD8分子，仅有1% ～5%即不表达CD4也不表达CD8，这少数T细胞即被称为双阴性T细胞(DNT细胞)［3］。Fischer等［4］用流式细胞仪检测分析20例健康人外周血单个核细胞，结果示:CD3+CD4－CD8－T细胞占 CD3+T细胞的4.1%(1.9% ～7.7%)，其中 γδTCR+DNT 比例较高，占 CD3+T 3.2%(2.1% ～ 3.6%)，αβTCR+DNT 仅占 0.9%(0.4% ～1.9%)，证明正常人体内亦存在少量DNT细胞。

2 DNT的来源

2.1 来源于CD8+T细胞 有些实验提示DNT细胞可能来源于CD8+T细胞表面CD8表达的下调，支持此说法的主要发现有:(1)在外周 DNT细胞中存在去甲基化的 CD8基因［5，6］;(2)体外培养CD8+T细胞，经IL-4和伊屋诺霉素处理后，能分化成可分泌IL-4及其他Th2细胞因子的DNT细胞［7］;(3)对DNT细胞基因高保守序列进行多个基因位点分析，得出DNT细胞的前体细胞可能是CD8+T细胞［8］;(4)体内刺激CD8+T细胞可导致DNT细胞的积累，且在DNT细胞上有过量表达的αβ-TCR Vβ，这与MHCⅠ类抗原筛选途径相符，亦可认为其来源于 CD8+T 细胞［3］。

尽管如此，亦有许多实验不支持DNT细胞来源于CD8+T细胞:(1)在某些小鼠模型中所鉴定出来的DNTreg细胞缺乏任何CD8 mRNA的表达［9］;(2)向有抗原表达的小鼠体内注射高纯度CD8+T细胞，抑或在体外培养CD8+T细胞时加入IL-2和/或 IL-4，CD8+T细胞并未分化出 DNTreg细胞［9］;(3)Ford等［10］用耗尽T细胞的骨髓细胞重建CD8缺乏小鼠和非致死剂量照射致胸腺切除小鼠，证明有DNT细胞出现于CD8-/-小鼠体内，并且对同系小鼠CD8+T细胞有抑制性调节作用。

2.2 来源于CD4+CD8+双阳性T(DP T)细胞 DP T细胞在胸腺发育过程中，需要经历阳性选择和阴性选择，只有以适当TCR亲和力发生特异结合才能最终发育为CD4单阳或CD8单阳的T细胞，而TCR高亲和力则可能有助于DP细胞逃离阴性选择并最终发育成为DNT细胞［11］。Wang等［12］在体外培养胸腺来源的DP T细胞，以高亲和力抗原刺激此细胞会使此细胞表面CD4、CD8表达水平下调，并最终分化发育为对自身幼稚T细胞增殖有抑制作用的DNT。Priatel等［13］的研究已证明部分DP T细胞可逃避胸腺阴性选择成为DNT细胞，并在外周接受抗原刺激增殖为功能性DNT细胞。

2.3 其他来源 张等［14］的研究证明，可从CD4+CD25－T细胞诱导DNT细胞生成，从C57BL/6(H-2b)小鼠的淋巴结和脾脏中分离提纯CD4+CD25－T细胞进行体外培养，与IL-2和/或IL-15及同种同源骨髓树突状细胞(BMDCs)共培养后，CD4基因表达下调，从而转变为DNT细胞，此DNT细胞保留稳定的表型，并且高度表达穿孔素，在体外和体内均可抗原特异性的抑制同种同型CD4+和CD8+，并可促进B细胞凋亡。Hayes等［15］的研究有另外建议，认为一些DNT细胞产生自前TCR+DN 细胞(晚期 DN3细胞，CD44 CD25+CD4－CD8－)。

3 DNT细胞在各疾病中的作用

3.1 在移植免疫中的作用

3.1.1 移植排斥:Zhang等［16］体外培养由小鼠体内分离出的DNT细胞，发现其能够抗原特异性地抑制并杀伤对供体有排斥作用的效应性CD8+和CD4+T细胞，在同基因型裸鼠体内选择性植入此细胞后，同种异体移植物的存活时间将被延长。同样的，对供受者MHCⅠ类抗原不匹配的患者，移植前向受者输注供者淋巴细胞(DLI)，可激活受者体内的DNT细胞，则移植后受者体内被供者淋巴细胞激活的DNT细胞可杀伤受者产生的抗供者T细胞，抑制免疫排斥，而对受者其他效应T细胞无杀伤作用，此实验证实，抗原特异性DNT细胞能通过抑制同种同源效应性T细胞来抑制受者抗供者器官的移植排斥反应［2，17］。

3.1.2 移植物抗宿主病(GVHD):Strober等［18］报导，DNT 细胞在体内或者体外均可以抑制免疫反应，他们发现来自成年鼠脾脏、胸腺和骨髓的DNT细胞或者是克隆群可以抑制体外混合淋巴细胞反应，当与异基因淋巴细胞共注射后可抑制GVHD。Abraham等［19］发现接受短疗程大剂量IL-2处理的小鼠体内CD3+CD4－CD8－细胞增多，在骨髓移植后，其GVHD降低但不影响移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemia，GVL)和移植排斥。

3.2 在自身免疫性疾病中的作用

3.2.1 下调免疫反应:DNT细胞可下调免疫反应，对某些自身免疫疾病有益。在小鼠自身免疫疾病模型中已证实，DNTreg可下调CD8+T细胞介导的免疫反应，与无抗原小鼠相比，带有TCR MHC-Ⅰ类抗原特异性转基因的小鼠的DNTreg细胞对同基因小鼠CD8+T细胞的杀伤作用更强，从而下调自身免疫疾病的免疫反应［13］。在非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠模型中，存在可分泌大量IL-10的DNT细能，将此细胞回输入NOD模型小鼠体内可预防小鼠胰岛素依赖性糖尿病的发生［20］。

DNT细胞诱导凋亡不足也可促进自身免疫疾病进展。Fas突变淋巴细胞增生(lpr)小鼠其活性CD4+、CD8+T细胞表面Fas基因缺陷，以致T细胞凋亡不足，导致非恶性淋巴器官肿大和自身免疫紊乱，以外周血CD3+CD4－CD8－T细胞增多为特征。Ford等［21］发现在Fas突变淋巴细胞增生(lpr)小鼠模型中积聚的大量DNT细胞同基因但表达功能性Fas受体的CD4+和CD8+T细胞仍有免疫抑制活性，可杀伤Fas+靶细胞，而对Fas－细胞无效，所以推测DNT细胞在体内积聚可能是由于这些小鼠体内的DNT细胞对Fas－细胞不能产生负性调控作用，而造成自身反应性增多。

3.2.2 免疫反应促进作用:目前研究发现除自身免疫性淋巴细胞综合症(ALPs)外，系统性红斑狼疮(SLE)的患者体内DNT细胞也大量增加［22，23］。Crispin 等［23］研究发现系统性红斑狼疮性肾炎的患者肾组织中DNT细胞积聚并分泌IL-17，而外周血中DNT细胞则分泌IFN-γ，这两种细胞因子均可促进SLE患者肾脏炎症的发展。Zhang等［24］随后在MRL/lpr(系统性红斑狼疮)鼠模型中也发现高表达IL-17和IL-23R的DNT细胞，并且其浓度与疾病严重程度呈正相关。Kyttaris等［25］用IL-23R处理取自MRL/lpr小鼠淋巴结的淋巴细胞可诱导出DNT细胞，此DNT细胞亦高表达IL-17，向淋巴细胞缺陷小鼠输注此DNT细胞后可导致小鼠狼疮样肾炎发生。

3.3 在肿瘤中的作用 目前针对DNT细胞在肿瘤中的作用还研究较少。Young等［26］在做移植模型研究时将DNT细胞和小鼠B细胞淋巴瘤A20细胞株共培养后再接种于(B6xBALB/c)F1小鼠，发现与单纯输注淋巴瘤A20细胞株的小鼠相比，同时输注DNT细胞的小鼠淋巴瘤发生率低，且无GVHD，而且将DNT细胞与淋巴瘤A20细胞株同时肌注于小鼠，可在局部使小鼠淋巴瘤被局限提示DNT细胞可作为淋巴瘤治疗的新策略。

4 DNT细胞的作用机制

DNT细胞需通过与反应性T细胞的接触才能发挥其免疫抑制作用，而不通过竞争生长因子或占据APC表面空间(位点)来抑制同源 CD8+T 细胞增殖［2，27］，如用碳酸脂膜系统将DNT细胞与反应性CD8+T细胞隔开，则DNT细胞不能抑制CD8+反应性T细胞的增殖［2］。

除了细胞间接触，DNT细胞通过TCR获取与效应T细胞同样的抗原的抗原的能力也很重要。和其他免疫细胞一样，DNT细胞也有从邻近细胞获取蛋白质的能力，而且DNT细胞能将通过TCR从APC获取的异种抗原表达于自身表面，可被表达相同TCR的CD8+T细胞特异性识别，引起抗原抗体结合介导的细胞间接触并触发抑制效应，封闭抗原或加入TCR抗体后都可使免疫抑制反应下调。

Fasl与其受体Fas结合是诱导T细胞凋亡的重要途径［27］，活化的CD4+或CD8+T细胞Fas表达逐渐增加，与调节性T细胞表面Fasl结合可诱导效应T细胞凋亡，使特异性免疫反应不致过激，以保持机体的稳态。有研究证实DNT可通过Fas/Fasl相互作用直接杀伤与其相接触的效应T细胞，当以抗体或融合蛋白封闭DNT细胞上的Fasl后，则其介导的免疫杀伤受抑［2］。

但Young等［26］的研究也表明，阻断Fas/Fasl途径并不能完全阻断DNT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，这说明DNT还可通过其他的途径发挥作用。比如通过分泌各种细胞因子发挥作用等。

随着对DNT细胞研究的不断深入并不断在更多疾病中扩展，我们对DNT细胞的认识越来越丰富，但目前我们得到的资料大多来源于动物模型，相对于复杂的人体系统来说，想将DNT细胞的理论应用于临床仍有许多问题需要解决。我们应进一步研究其在不同疾病发病、进展及转归过程中上下游的特异基因突变及细胞因子表达、对药物反应等各方面的变化规律，以期推动疾病的免疫治疗，造福患者。

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