川北地区胃癌差异表达基因的筛选

王朝莉，敬保迁，李 丽，冯 莉(川北医学院免疫学与分子生物学研究所，南充 637000;通讯作者，E-mail:bqjing@yahoo.com.cn)

胃癌是严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤之一，居所有恶性肿瘤之首。研究表明，基因与肿瘤的发生、发展有着非常密切的关系。因此，筛选胃癌特异表达基因，分析这些基因表达与胃癌发生、发展和转移间的关系，发展对胃癌高危人群进行筛查或早期实验室诊断方法，将这些特异表达基因作为分子靶位，发展新的抗肿瘤药物和抗肿瘤疫苗已是目前紧迫需要。本实验采用抑制消减杂交技术(SSH)，构建胃低分化腺癌cDNA消减文库，与公共数据库中已知基因和人类EST比较，获得序列标签，通过RT-PCR技术进行筛选，期望获得本地区胃癌标本中特异表达基因，为胃癌的靶向基因治疗奠定实验室基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织来源于川北医学院附属医院普外科住院部的胃癌患者(获得知情者同意情况下)，经临床及病理诊断证实。主要试剂:RNAiso plus(TaKaRa);PCR Select cDNA Subtraction;50×PCR Enzyme Mix(Clontech);Advantage PCR Cloning(Clontech);NucleoSpin ExtractⅡ(Clontech);PCR Purification(Qiagen);Prime-ScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)。

1.2 实验方法

1.2.1 胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜组织总RNA的分离 取胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜组织，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒，按使用说明提取癌组织和癌旁组织总RNA。波长260-280 nm处，核酸蛋白检测仪进行浓度分析和纯度鉴定。

1.2.2 cDNA合成 使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech)，参照使用说明，取胃癌组织和癌旁组织总RNA各2 μg，以RT-PCR方法扩增合成双链 cDNA，产物经 NucleoSpin ExtractⅡ(Clontech)纯化。

1.2.3 四碱基内切酶RsaⅠ酶切 以胃癌cDNA为检测子(Tester)，癌旁组织为驱动子(Driver)。取Tester和 Driver的 cDNA 各 43.5 μl，加入 RsaⅠ(10 U/μl)1.5 μl，置于37 ℃2 h。常规酚 -氯仿 -异戊醇抽提，无水乙醇沉淀。

1.2.4 连接相应接头 RsaⅠ酶切后的胃癌组织分为2组:Tester1和 Tester2，分别连接相应的接头Adaptor 1和Adaptor 2R。每组各加入Tester cDNA 2 μl及T4DNA 连接酶1 μl，分别与Adaptor 1 和Adaptor 2R于16℃反应过夜。

1.2.5 两次消减杂交反应 将连有接头Adaptor 1和Adaptor 2R的TestercDNA 1.5 μl分别与经RsaⅠ酶切后的Driver cDNA 1.5 μl于68℃8 h进行第一次消减杂交;然后混合2份杂交标本，加入过量新鲜变性的Driver cDNA 1 μl，于68℃杂交过夜进行第二次消减杂交。

1.2.6 两次PCR扩增反应 以PCR Select cDNA Subtraction试剂盒(Clontech)进行。以稀释后的第二次消减杂交产物为模板，以试剂盒中的引物1进行第一轮抑制性PCR扩增，反应参数为:75℃5 min;94℃30 s，以 94 ℃30 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min，27个循环;最后72℃6 min。再将稀释后的第一轮PCR产物作为模板，以试剂盒中的巢式PCR引物1和引物2进行第二轮PCR扩增，反应参数为:94 ℃30 s、68 ℃30 s、72 ℃1.5 min，20 个循环。以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定质量，并以PCR Purification(Qiagen)纯化PCR产物。

1.2.7 消减杂交后PCR产物的克隆与鉴定 将上述PCR产物与pGEM-Tasy(Promega)载体连接，转化感受态细胞 JM109，铺于含 x-gal，IPTG，Amp的Luria-Bertani培养基平板，蓝白斑筛选和快速琼脂糖凝胶电泳方式鉴定阳性克隆，随机挑选29个克隆送上海基康生物技术有限公司进行测序，通过Gen-Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)检索和同源性分析。

1.2.8 半定量RT-PCR分析 收集5例新鲜的胃癌及癌旁正常黏膜组织，以RMPI 1640培养液洗涤3次，液氮研磨后加入适量RNAiso plus(TaKaRa)，按试剂说明书进行RNA提取，凝胶电泳及核酸蛋白仪鉴定质量和含量。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒(TaKaRa)，参照使用说明，取胃癌组织和癌旁组织总RNA各1 μg，合成cDNA。将通过GenBank检索获得的序列标签进行PCR扩增，扩增引物分别为:NBPF1V-F:5’-TCACTCCAGATGAGCCAGACA-3’，NBPF1V-R:5’-CCTCAGGGACTTTGCTTTCTT-3’;RXFP2-F:5’-CTGATTGCCTGATGGGTGTT-3’，RXFP2-R:5’-ATGACTGAGGTCTGCCGTTTT-3’;QDPR-F:5’-CCATCTGGCTACCAAGCATCT-3’，QDPR-R:5’-AGGGTAACCGGGAGCACACAG-3’;FAM48AV1-F:5’-CCGAGAACAGACCTGAGCAA-3’，FAM48AV1-R:5’-TGTATGCCGATGATGATGTAGC-3’;FAM48AV2-R:5’-T TAGTCCAGAATGAAGCCAAATGTC-3’，FAM48AV2-R:5’-ATACCGAAGACTGAACTGACACG-3’;RPL13A-F:5’-AGCTCATGAGGCTACGGAAA-3’，RPL13A-R:5’-CTTGCTCCCAGCTTCCTATG-3’;RPL19-F:5’-ATCGATCGCCACATGTATCA-3’，RPL19-R:5’-GCGTGCTTCCTTGGTCTTAG-3’。

扩增体系:25 μl体系。反应条件:94℃3 min预变性，94 ℃30 s，59 ℃30 s，72 ℃1 min，30 个循环，72℃ 5 min。产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果

2.1 细胞总RNA的提取

用RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜组织总RNA，电泳结果显示条带清晰，结构完整，质量较好［1］，可以继续实验。

2.2 消减杂交

以RsaⅠ酶切的胃癌cDNA为tester，正常组织cDNA为driver进行SSH和抑制性PCR，产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，在200-800 bp之间的存在一系列基因片段(见图1)。

2.3 序列克隆与测序分析

通过GenBank检索和同源性分析，获得5个特异性序列标签，分别是NBPF1基因(neuroblastoma breakpoint family，member 1)，RXFP2 基因，QDPR 基因(醌型二氢蝶呤还原酶基因，quinoid dihydropteridine reductase)，FAM48A基因(亦称 C13orf19)和ACTB基因。

2.4 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

采用半定量 RT-PCR方法检测 NBPF1、FAM48A、RXFP2、QDPR基因在不同癌组织中的表达情况，同时以RPL19和RPL13A作为内参基因(见图2)。结果表明:RXFP2在不同的组织中均表达，且在癌组织中的表达量明显高于癌旁正常组织，富有规律性;QDPR在所取的标本中未见表达;NBPF1仅在部分标本中表达;而FAM48A的两种变异体中，FAM48A1表达不全，FAM48A2特异性不强。

图1 消减效率分析结果Fig 1 PCR analysis of subtraction efficiency

图2 逆转录聚合酶链式扩增反应筛选Fig 2 Screening of differentially expressed genes by reverse transcription-polymerase chain reaction

3 讨论

胃癌的发生发展是一个多基因多步骤的过程，只有在确定癌发生发展中相关基因的变化后，深入研究这些基因在细胞分化发育过程中的具体作用，才能从分子水平阐明胃癌的形成和转移机制，寻找到针对性较强的控制方法。抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)是近年发展的能高效快速克隆差异表达基因的新技术之一。它以抑制性PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体，是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的有效方法。本实验采用SSH技术从川东北地区临床患者胃癌组织中筛选癌组织特异表达基因的序列标签NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR，通过RT-PCR技术进行筛选，获得在胃癌组织及癌旁正常黏膜组织中差异表达基因RXFP2。

RXFP2，是一种糖蛋白激素，富含多个亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体，富含大量N末端的胞外域的7次跨膜蛋白。其特异配体为胰岛素样激素3(INSL3)［2-4］，又称松弛素样因子或睾丸间质细胞源胰岛素样肽。INSL3的氨基酸序列含有A，B 2个肽链，其肽链与胰岛素样激素超家族成员的A、B链的同源性很高，B链的C末端一段序列是INSL3与其受体结合的关键部位。INSL3表达于各种生殖组织，被认为是人类睾丸间质细胞分化成熟的标志。特别应指出的是，近年研究表明，RXFP2参与了人前列腺癌［5］、肝癌［6］和甲状腺癌［7，8］的侵袭与转移。但是否参与了胃癌的侵袭与转移直至目前也还未见报道。

本研究采用高通量方法从临床病理标本中筛选出川北地区胃癌特异表达RXFP2基因，为临床胃癌高危人群的筛选、早期诊断、病情考核奠定实验室基础。

［1］ 王朝莉，李丽，陈果，等.川北地区胃癌特异性表达基因的克隆［J］.中国医药导报，2011，8(5):19-20.

［2］ Claasz AA，Bond CP，Bathgate RA，et al.Relaxin-like bioactivity of ovine insulin 3(INSL3)analogues［J］.Eur J Biochem，2002，269(24):6287-6293.

［3］ Kubota Y，Net S，Farmer PJ，et al.Leydig insulin-like hormone，gubernacular development and testicular descent［J］.J Urol，2001，165(5):1673-1675.

［4］ Tomboc M，Lee PA，Mitwally MF，et al.Insulin-like 3/relaxin-like factor gene mutations are associated with cryptorchidism［J］.J Clin Endocrinol Metab，2000，85(11):4013-4018.

［5］ Klonisch T，Müller-Huesmann H，Riedel M，et al.INSL3 in the benign hyperplastic and neoplastic human prostate gland［J］.Int J Oncol，2005，27(2):307-315.

［6］ Lin CK，Jin JS，Yu CP，et al.Expression of LGR8 and related biomarkers in hepatocellular carcinoma:correlation with clinicopathological parameters［J］.Chin J Physiol，2011，54(3):161-168.

［7］ Hombach-Klonisch S，Hoang-Vu C，Kehlen A，et al.INSL-3 is expressed in human hyperplastic and meoplastic thyrocytes［J］ .Int J Oncol，2003，22(5):993-1001.

［8］ Hombach-Klonisch S，Bialek J，Radestock Y，et al.INSL3 has tumor-promoting activity in thyroid cancer［J］.Int J Cancer，2010，127(3):521-531.

［9］ 李丽，王朝莉，陈果，等.抑制性消减杂交筛选食道癌相关基因［J］.川北医学院学报，2007 ，22(5):421-424.