NK4基因转染对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学特性的影响

李松林，李 霏，刘新莉，尹元琴(中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所二室，沈阳 000;辽宁省肿瘤医院血液生物治疗科;通讯作者，E-mail:yuandouwang@yahoo.com.cn)

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，目前在我国的发病率逐年增加，且有年轻化趋势。因此，研究乳腺癌的治疗新策略显得尤为重要。研究表明，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是由间质细胞产生的一种多功能细胞因子［1］，通过结合其受体c-Met使其激活成p-Met，在肿瘤侵袭和转移中发挥着重要的作用［2］。NK4是一种新的肝细胞生长因子拮抗剂，它是由HGFα链的447个氨基酸和4个kringle结构所组成，故命名为NK4，相对分子量是50 kD［3］。NK4能够与c-Met受体结合，但并不激活c-Met受体，因此能够竞争性抑制HGF对c-Met受体的激活作用。研究证实NK4体外可以抑制HGF诱导的多种肿瘤细胞的生长、运动和侵袭［4-7］。但在乳腺癌中的作用，目前国内外少见报道。为此我们构建了NK4重组慢病毒载体［8］，并进行转染研究，探讨NK4基因对HGF诱导MDA-MB-231的细胞生长、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

乳腺癌细胞株MDA-MB-231培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO2孵箱中。

1.2 细胞转染

将NK4病毒载体转染到231细胞中，最适感染复数(multiplicity of infection，MOI)为 10，载体转染时培养基中添加聚凝胺调整浓度至8 μg/ml，以正常培养和空白载体转染的细胞作为对照。

1.3 转染细胞NK4基因mRNA水平表达检测

取NK4转染组、空载体组和对照组细胞各5×106，常规提取总RNA，参照NK4基因序列设计引物，上游引物:5’-ATCAGGCAAGATTTGTCAGCG-3’;下游引物:5’GAGCAGTAGCCAACTCTCGGAT-3’。用上述两种引进行RT-PCR反应，阳性者可扩增出453 bp片段。β-actin作为内参照。

1.4 NK4蛋白和p-met蛋白表达的检测

采用Western blot法检测NK4蛋白和p-met蛋白表达。NK4转染组、空载体组和对照组的细胞孵育2 d，分别收集对数生长期的细胞培养液上清和细胞裂解液。聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移到硝酸纤维膜上，5%牛奶封闭，加入兔抗人单克隆抗体4℃过夜，TBST洗3次，加入二抗，TBST冲洗3次后加入ECL发光液曝光。

1.5 细胞生长曲线测定

按照每孔5×103个细胞接种于96孔板，分为MDA-MB-231组和NK4转染组，每组设5个复孔，每组加入10 ng/ml的HGF。每孔加入MTT溶液10 μl，37 ℃ 培养，4 h 后加入 DMSO 150 μl震荡 10 min。在酶联免疫检测仪OD570nm读取吸光值。抑制率计算公式为:抑制率=1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)。

1.6 细胞侵袭能力测定

采用8 μm的Transwell chamber，对数生长期的MDA-MB-231细胞组，空载体组和NK4转染组，胰酶消化后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基调整成1×105的细胞悬液，上室每孔加入0.5 ml的细胞悬液(即每孔5×104个细胞)，下室加入含有10 ng/ml HGF的培养基孵育48 h。取出滤膜，用棉签擦尽上室面Matrigel和未侵袭的细胞，10%中性甲醛固定30 min，常规HE染色，200倍光镜下随机选取5个视野，计数滤膜下室面的细胞数，以平均数作为侵袭指数。

1.7 统计学分析

采用SPSS13.0软件对数据进行 t检验和方差分析及两样本比较的LSD检验。数据以±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染细胞NK4 mRNA基因的表达

对NK4转染组、空载体组和对照组样品进行RT-PCR反应，均可扩增出长度为1 434 bp的特异性条带，而空载体组和对照组则没有特异性条带。说明NK4转染乳腺癌后能够正常转录(见图1)。

图1 三组细胞中NK4基因的表达Fig 1 Identification of NK4 gene

2.2 转染细胞NK4蛋白和p-met蛋白的表达

取NK4转染组、空载体组和对照组细胞培养液上清液进行Western blot实验，结果显示:NK4转染组能够表达NK4蛋白，而对照组和空载体组中无NK4表达，且与对照组和空载体组相比转染组中pmet蛋白的表达明显减弱(见图2)。

图2 各组细胞中NK4及p-met的表达Fig 2 Expression of NK4 and p-met in three groups

2.3 细胞生长曲线测定

结果显示NK4转染组与对照组和空载体组相比能够明显抑制由HGF诱导的细胞生长(P＜0.01，见图3)。

2.4 细胞侵袭能力测定

Transwell小室法观察转染NK4基因对乳腺癌细胞侵袭的影响，结果显示，转染NK4能够显著抑制HGF诱导的乳腺癌细胞的侵袭(P＜0.01，图4，5，见第248页)。

图3 转染NK4对MDA-MB-231细胞的抑制作用Fig 3 The cell inhibition of NK4 on MDA-MB-231

图4 Transwell小室法观察转染NK4基因对乳腺癌细胞侵袭的影响 (×100)Fig 4 Effect of NK4 transfection on MDA-MB-231 invasion by Transwell assay (×100)

图5 对照组、空载体组及转染NK4组48 h后MDA-MB-231侵袭情况对比Fig 5 The inhibition on MDA-MB-231 invasion of null，vector and p-Lenti-NK4 at 48 h

3 讨论

乳腺癌已经成为女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性所罹患的全部恶性肿瘤的23%［9］，在美国乳腺癌已经成为女性恶性肿瘤第一位［10］。因此研究乳腺癌细胞的侵袭和转移的机制，探索有效地抑制乳腺癌的生长、侵袭和转移的方法显得至关重要。

HGF是由间质细胞产生的一种多功能细胞因子。最初引起对肝细胞具有很强的丝裂原作用而命名［1］。HGF具有诱导细胞有丝分裂、刺激细胞迁移、对抗细胞因子诱导凋亡的作用。通过包括癌细胞在内的多种细胞膜上的特异性受体c-Met发挥生物学作用［2］。HGF/c-Met可以激活蛋白激酶结构域中的PTK，导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)发生磷酸化上调u-PA(内皮细胞尿激酶-纤溶酶原激活系统)，引起一系列的生物反应，诱导基质金属蛋白酶的表达，促进细胞外基质的降解，最终导致肿瘤的侵袭和转移［11］。最近，有研究证实乳腺癌中HGF和c-Met的表达与正常组织相比明显升高，且HGF的水平与乳腺癌的肿瘤大小、临床分期、淋巴结状况及组织学分级有明显关系［12-14］。因此，如果能够抑制HGF与其受体c-Met的结合将对乳腺癌的治疗起到重要作用。NK4是HGF最具代表性的全面的拮抗剂，它具有拮抗HGF和抑制血管生成的双重作用。本实验通过对乳腺癌细胞MDA-MB-231转染NK4重组慢病毒载体，发现转染NK4基因的细胞组能够向培养基中大量分泌NK4蛋白，体外实验结果显示NK4能够竞争性抑制HGF与乳腺癌细胞上cmet受体的结合，抑制了c-Met受体的磷酸化。从而阻断了HGF/c-met信号通路对乳腺癌细胞促肿瘤作用，NK4基因的转染能够明显地抑制乳腺癌细胞的生长和侵袭，为进一步的体内实验和乳腺癌的临床治疗提供了研究基础。

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