美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的含量测定

黄 丽，杨永寿，李夸巧，杨兴彪，肖培云

（大理学院云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000）

美洲大蠊（Periplaneta americana）为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，首见于《本草纲目拾遗》，也称其为石姜、滑虫、偷油婆，茶婆子，灶蚂子等。其入药始载于《神农本草经》〔1〕，近几年来，随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，目前以美洲大蠊为原料的多个产品相继研发成功，如“康复新滴剂”〔2〕、“心脉龙注射液”〔3〕、“肝龙胶囊”〔4〕等系列新药。

文献报道，美洲大蠊中含有大量的氨基葡萄糖类化合物〔5〕，氨基葡萄糖是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物，俗称氨基糖，氨基葡萄糖分为硫酸氨基葡萄糖（如硫酸软骨素）和盐酸氨基葡萄糖两种。氨基葡萄糖最重要的用途是构成软骨蛋白多糖的主要成分之一。硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，ChS）是一种天然酸性黏多糖，由D－葡萄糖醛酸和N－乙酰－D－氨基半乳糖以1，3－糖苷键结合的双糖为基本单位聚合而成〔6〕，它属于氨基葡萄糖类化合物，具有多种生物活性，有抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、降血脂及增强机体免疫功能〔7-12〕等重要生物活性，目前已得到了广泛的重视和研究，并已应用于医药、化妆品和保健食品等行业〔13〕。有文献〔14〕报道硫酸软骨素的含量测定可用AHMT（4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三唑）法，其原理为AHMT与己糖醛酸或硫酸软骨素，在氧化剂KIO4的碱性溶液中，AHMT与ChS生成紫色的衍生物，在540 nm波长处通过测定该衍生物的吸光度来测定ChS的含量，根据此原理，可用AHMT法来测定美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的含量，为美洲大蠊的进一步研究提供检测方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 紫外-可见分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司），电子恒温水浴箱（DZKW-4，上海科析试验仪器厂），电子分析天平（AL204-IC，梅特勒-托利多仪器上海有限公司），傅立叶红外光谱仪（Nicolet 380FT-IR，美国Nicolet仪器公司），旋转蒸发仪（RE-3000A，上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药 美洲大蠊药材采自云南省大理州弥渡县5家不同的养殖场，分别编号为：20120827、20120302、20120415、20120727、20121126，硫酸软骨素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：140792-201001），AHMT（上海如吉生物科技发展有限公司），其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取硫酸软骨素对照品250 mg，置50 mL量瓶中，加1 mol/L的KOH溶解，定容，摇匀，即得5 mg/mL的对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取约0.5 g脱脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，加入4 mol/L的NaOH溶液17.5 mL，于40℃的水浴锅中温浸1 h，取出，冷却，定容至25 mL，过滤，精密移取续滤液10 mL，加入1%（g/mL）的活性炭脱色，过滤，即得供试品溶液。

2.1.3 AHMT溶液的配制 称取0.50 gAHMT，加0.5 mol/L的HCl溶液溶解，于100 mL量瓶中定容，即得浓度为5 g/L的AHMT溶液。

2.1.4 KIO4溶液的配制 称取1.00 gKIO4，加0.2 mol/L的KOH溶液溶解，于100 mL量瓶中定容，即得浓度为10 g/L的KIO4溶液。

2.2 吸收波长的选择 分别精密移取“2.1.1”、“2.1.2”项下的对照品、供试品溶液各0.5 mL，分置10 mL量瓶中，加2 mol/L的KOH溶液3 mL，再加5 g/L的AHMT溶液3 mL〔13〕，密塞，混匀，置90 ℃水浴锅中加热25 min，取出，冷却，加10 g/L的KIO4溶液1 mL，定容至刻度，摇匀，以显色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，在400～800 nm波长下扫描，得吸收光谱曲线。结果表明，对照品和供试品溶液在540 nm处均有最大吸收。见图1。

2.3 对照品和供试品的红外光谱比较 取“2.1.2”项下制备的供试品溶液，冷冻干燥，得美洲大蠊氨基葡萄糖提取物。分别取一定量的对照品和提取得到的供试品，在相同条件下进行红外光谱检测。结果表明，供试品与对照品具有相似的红外吸收光谱。见图2。

图1 对照品和供试品的紫外吸收光谱图

图2 对照品和供试品的红外吸收光谱图

2.4 提取条件考察 本试验对NaOH溶液的浓度、料液比、提取时间、提取温度和显色时间5个因素进行考察。

2.4.1 NaOH溶液浓度考察 精密称取约0.5 g脱脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按料液比为1∶35加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、

4.5 mol/L的NaOH溶液后，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下的方法显色，以显色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，在540 nm波长处用1 cm比色皿测定溶液吸光度，结果表明，当NaOH溶液的浓度为4 mol/L时，美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的含量最高。

2.4.2 料液比考察 精密称取约0.5 g脱脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45比例加入4 mol/L的NaOH溶液后，按“2.4.1”项下的方法处理，结果表明，当料液比为1∶35时，测得美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的含量最高。

2.4.3 提取时间考察 精密称取约0.5 g脱脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶35比例加入4 mol/L NaOH溶液，在40 ℃下提取0.5、1、2、3、4、5、6、7 h后，按“2.4.1”项下的方法处理，结果表明，当提取时间为1 h时，美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的含量达到最大值，所以选择提取时间为1 h。

2.4.4 提取温度考察 精密称取约0.5 g脱脂后的美洲大蠊粉末，置50 mL的比色管中，按1∶35比例加入4 mol/L NaOH溶液，分别在30、40、50、60、70 ℃下温浸1 h后，按“2.4.1”项下的方法处理，结果表明，当提取温度为40℃时，美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的含量最高。

2.4.5 显色时间考察 精密移取“2.1.1”项下的对照品溶液0.5 mL（n=7），分别置10 mL量瓶中，按“2.4.1”项下的方法处理，结果表明，当显色时间为25 min时，吸光度值最大。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线的绘制 精密移取“2.1.1”项下的对照品溶液0.05、0.15、0.25、0.40、0.65、0.75 mL，分别置10 mL量瓶中，按“2.4.1”项下的方法处理，以吸光度A为纵坐标，以对照品溶液的浓度C（mg/mL）为横坐标，进行线性回归，得回归方程A=1.9914C+0.0114，r=0.9998，结果表明硫酸软骨素在0.025～0.375 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验 精密移取“2.1.1”项下的对照品溶液0.5 mL，置10 mL的量瓶中，按“2.4.1”项下的方法处理，连续测定6次，记录吸光度值，计算RSD值，RSD为0.15%，结果表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密移取“2.1.2”项下的供试品溶液0.5 mL，置10 mL的量瓶中，按“2.4.1”项下的方法处理，间隔30 min测定1次吸光度，连续考察4 h，RSD值为1.92%，结果表明供试品溶液在4 h内稳定。

2.5.4 重复性试验 精密称取约0.5 g脱脂后的美洲大蠊粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下的方法显色，以显色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，于540 nm处测定吸光度。结果表明，美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的平均含量为180.35 mg/g，RSD为3.11%（n=5）。

2.5.5 加样回收试验 精密称取已知含量的美洲大蠊粉末（已脱脂）约0.3 g，分别加入7 mL“2.1.1”项下的对照品溶液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下的方法显色，以显色后的4 mol/L NaOH溶液作空白，于540 nm处测定吸光度，计算美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的平均回收率。见表1。2.6 供试品测定 分别精密称取批号为20090827、20100302、20100415、20110727、20121126 的 样 品 ，每个批号3份，每份约0.5 g，按“2.4”项下考察得到的最佳条件制备供试品溶液，按最佳显色条件测定。见表2。

表1 美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的回收率测定（n=6）

3 讨论

硫酸软骨素的含量测定方法有比色法〔15〕、咔唑比色法〔16〕、间苯三酚法〔17〕、AHMT法〔14〕等，但比色法和咔唑法操作繁琐、重现性和准确度较差，所以目前主要采用AHMT法，该法操作简便、准确度和重现性好、回收率高。硫酸软骨素属于氨基葡萄糖类化合物，所以也可用AHMT法来测定美洲大蠊中氨基葡萄糖类化合物的含量。

由单因素考察可得，提高NaOH溶液的浓度有助于黏多糖的提取，但随着NaOH浓度的提高，提取液颜色略加深，同时有异味出现，这是由于在浓碱作用下，部分蛋白的糖肽键断裂，并释放出单糖分子，处于糖链还原端的糖基在碱性条件下，逐渐生成间糖酸和异糖酸而脱落，脱落的糖类物质发生副反应，产生颜色和异味，同时黏多糖分子量变小〔18〕。

表2 供试品测定结果（n=5）

实验结果表明，美洲大蠊药材中氨基葡萄糖类化合物的含量存在较大差异，不同批次的药材中氨基葡萄糖类化合物的含量不同，这可能与美洲大蠊药材的喂养饲料、生长环境、养殖时间不同有关，因此必须进行美洲大蠊药材的规范化养殖（GAP）研究，制定统一的标准操作规程（SOP），最终实现美洲大蠊药材的规范化养殖。

〔1〕孙星衍.神农本草经〔M〕.北京：商务印书馆，1955：90.

〔2〕蒋永新，王熙才，金从国，等.康复新体外诱导胃癌BGC-823细胞调的亡实验研究〔J〕.昆明医学院学报，2006，27（2）：5-9.

〔3〕田双双，陈光勇，刘光明.心脉龙的研究进展〔J〕.中国民族民间医药，2009，18（16）：14.

〔4〕杜一民，陈鸿珊，李树楠，等.治疗乙型肝炎新药肝龙胶囊的药效学初步研究〔J〕.时珍国医国药，2006，17（8）：1369-1371.

〔5〕耿福能，张乐，陈开晓，等.一种以美洲大蠊为原料制备氨基葡萄糖盐酸盐的方法：中国，102633844A〔P〕.2012-08-15.

〔6〕张莉.硫酸软骨素含量测定方法的研究进展〔J〕.天津药学，2013，25（2）：44-46.

〔7〕张珣，王静凤，李辉，等.海参硫酸软骨素抑制小鼠Lewis肺癌生长和转移作用的研究〔J〕.营养学报，2011，33（6）：597-601.

〔8〕刘武.硫酸软骨素药理作用研究进展〔J〕.中国药业，2008，17（8）：64.

〔9〕姚晓燕.黄鳝骨硫酸软骨素多糖降血脂功能研究〔J〕.中国医药导报，2011，8（30）：31-33.

〔10〕杨勇，陈旭，昝中学，等.盐酸氨基葡萄糖联合硫酸软骨素治疗腰椎小关节骨关节炎的临床观察〔J〕.华西医学，2012，27（12）：1809-1813.

〔11〕谢小冬，苏刚，辇晓峰，等.硫酸软骨素-A对X射线辐照损伤小鼠的保护作用〔J〕.西北师范大学学报，2013，49（1）：86-91.

〔12〕戴小慧，章建芳，陈龙.硫酸软骨素免疫增强作用研究〔J〕.中国药业，2006，15（16）：16-17.

〔13〕Zhou S.Health food useful for improving water content of skin，obtained by mixing components including hyaluronic acid，chondroitin sulfate，fish collagen，vitaminC powder，glycine，proline，extract of grape seeds and starch：China,102210425A〔P〕.2011-10-12.

〔14〕刘坤，高华.AHMT分光光度法测定软骨鱼类硫酸软骨素〔J〕.中国海洋药物志，2005，24（4）：21-23.

〔15〕苏玉永，王虎，李晓华.比色法测定复方硫酸软骨素胶囊中硫酸软骨素的含量〔J〕.中国医院药学杂志，2006，26（3）：351-352.

〔16〕周叶，赵婷，冯伟伟，等.咔唑法测定中华鲟软骨中硫酸软骨素的含量〔J〕.安徽农业科学，2011，39（19）：11597-11598.

〔17〕王亚，陈彦，胡玲，等.硫酸软骨素制备工艺的优化〔J〕.中国生化药物杂志，2006，21（1）：12-14.

〔18〕李建武，肖能应，余瑞元，等.生物化学实验原理和方法〔M〕.北京：北京大学出版社，1994：125-165.