微生物制剂MP代谢产物的蛋白质组分析

赵敏，汪长国，李宁，夏庆友，戴亚

1川渝中烟工业有限责任公司技术中心，成都市成龙大道1段56号 610066;2 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆市北碚区天生路2号 400715;3 西南大学生物技术学院，重庆市北碚区天生路2号 400715

烟草（Nicotiana tabacum）是重要经济作物，也是植物学研究中的重要模式植物。汪长国等人从烟田土壤中分离筛选出的芽孢杆菌并制备成一种微生物制剂MP，采收前烟叶喷施MP制剂可改善烟叶重要香味成分和蛋白质含量，提高烟叶品质[1]。赵敏等人研究发现，喷施微生物制剂MP后烟叶中可能具有抗菌功能的组织蛋白酶B基因表达量增加[2]，与植物抗病性相关的几丁质酶和逆渗透蛋白表达量也有增加[3]。但该制剂分泌的代谢产物含有哪些蛋白以及这些蛋白对烟叶品质的作用机制还有待于进一步研究。

“鸟枪法”（Shotgun）蛋白质学研究策略是基于复杂蛋白质混合物的酶解，它可以大规模的筛选复杂样品中的多肽和蛋白，并快速鉴定细胞、组织和器官中的蛋白质表达谱[4-6]，其基本原理是蛋白质溶液或经过SDS-PAGE分离的蛋白质条带经过酶解后形成肽段混合物，肽段混合物经过一维液相色谱或二维液相色谱分离，串联质谱检测，然后通过在相应的数据库中检索，从而鉴定蛋白质。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的“鸟枪法”（Shotgun）蛋白质组学策略一次分析可以鉴定出上千个蛋白质，该技术已经广泛应用于一些模式植物中，如拟南芥[7-8]、大豆[9-10]、水稻[11]等。本实验利用Shotgun蛋白质学方法分析鉴定微生物制剂MP代谢产物的蛋白质组成分，旨在揭示MP制剂改善烟叶品质的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

微生物制剂MP由汪长国等人从烟田土壤中分离、筛选出有益微生物（巨大芽孢杆菌， Bacillus magaterium）[1]。

1.1.2 试剂与仪器

APS、丙烯酰胺（Acrylamide）、N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、硝酸银、TEMED、β-巯基乙醇、尿素、柠檬酸、NH4HCO3、DTT购于BBI公司，考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、SDS购自AMERSCO，甲酸、乙腈（ACN）、Trypsin、三氟乙酸（TFA）购自Sigma，IPTG购自TAKARA，预染蛋白质marker购自Fermentas，吲哚乙酸（IAA）购自GE，Econo-Pac Chromatography Column 购自Bio-Rad，KH2PO4、盐酸、硫代硫酸钠、甲醇、冰醋酸、甲醛、NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O、溴酚蓝购自Sigma公司。

Hoefer SE600 Ruby 型垂直电泳仪购自美国应用生物系统公司（ABI），LC-MS/MS购自Thermo Finnigan，San Jose，CA。

1.2 方法

1.2.1 微生物制剂MP代谢物的提取

将该微生物接种牛肉膏蛋白胨液体培养基，振荡培养72 h后取菌液，离心后取上清液过滤，得到代谢产物。

1.2.2 SDS-PAGE电泳检测

将得到的代谢产物加入3×上样缓冲液，煮沸离心后，取上清液进行电泳。进行SDS-PAGE电泳时，分离胶为12.5%，压缩胶为5%。分别采用7 mA和15 mA的电流强度进行稳流电泳。电泳结束后进行银染。

银染过程首先将凝胶在固定液中固定1 h以上；随后，用清洗液浸泡3次；在定影液中反应2 min；用ddH2O洗涤3次；在染色液中反应30 min；ddH2O涮洗几次；用显影液浸泡数分钟，直到显出蛋白质条带；加入停止液，反应终止；ddH2O洗凝胶3次，用10%的醋酸保存。

1.2.3 银染染色胶酶解

将电泳条带切下，在每管凝胶颗粒中加入200-400 μL脱色剂（30%ACN/100 mmol/L NH4HCO3）对凝胶进行脱色；清洗至透明，去除上清并冻干；加入100 mmol/L DTT，56℃孵化30 min；去上清，加入200 mmol/L IAA，暗处放置20 min；去上清，加入100 mmol/L NH4HCO3，室温15 min；去上清，加入乙腈；5 min后吸去，冻干加入 2.5-10 ng/μL Trypsin溶液，在37℃条件下反应过夜；转移酶解液到新的离心管中，凝胶中加入100 μL抽提液（60%ACN/0.1%TFA），超声15 min，合并酶解液冻干。再将酶解液进行LC-MS/MS分析。

2 结果与分析

2.1 微生物制剂MP代谢产物分离及鉴定

将微生物制剂MP的主要成分巨大芽孢杆菌培养后提取并过滤，将过滤后的代谢产物通过SDS-PAGE鉴定，电泳结果见图1。根据电泳结果，将MP制剂代谢产物SDS-PAGE胶条带分为9段进行酶解。

图1 微生物制剂MP代谢产物的SDS-PAGE检测

2.2 LC-MS/MS鉴定分析

利用Shotgun蛋白质学分析微生物制剂MP中的代谢产物蛋白质组成分。将MP制剂代谢产物SDSPAGE后的胶条带进行LC-MS/MS鉴定分析（图2）。最终，共鉴定了35个非重复蛋白质。分析鉴定蛋白的理论分布结果显示，几乎所有蛋白的分子量均大于20 kD，等电点均分布在4-7的范围内，只有1个蛋白的等电点大于8（表1）。鉴定蛋白的理论等电点和分子量见图3。

图2 微生物MP制剂代谢产物9个区段的质谱图

图3 微生物MP制剂代谢产物鉴定蛋白的理论等电点和分子量分布

表1 MP制剂代谢产物中鉴定的蛋白

续表1

2.3 KEGG代谢通路分析

为了进一步揭示所鉴定的MP制剂代谢产物中蛋白参与的代谢和通路，将这些鉴定的蛋白检索KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）参考通路数据库。结果显示，所鉴定的蛋白几乎都与代谢有关，其中参与氨基酸代谢、糖酵解、三羧酸循环、丙酮酸盐代谢的蛋白最多（图4）。除与代谢相关的蛋白外，还有一些蛋白参与蛋白降解。如氨基酰组氨酸二肽酶[12-13]、嗜热菌状金属蛋白酶[14-15]、尿刊酸水合酶[16-17]、组氨酸氨裂解酶[18]。

图4 MP制剂代谢产物中鉴定蛋白涉及的生物通路

3 小结与讨论

烟叶中蛋白质含量与烟草品质密切相关。烟叶中蛋白质含量过高，在燃烧时会发出难闻的气味，燃烧性能不良，制成品味苦、涩、辛辣，影响烟叶的香味品质和安全性[19]。上部烟叶蛋白质含量较高、烟碱含量较高、化学成分不协调等是制约上部烟叶工业可用性的重要因素。研究表明，微生物制剂MP能有效降低上部烟叶的蛋白质含量、增加香味成分并提高感官品质[1]。然而，该制剂分泌的代谢产物含有哪些蛋白以及这些蛋白对烟叶品质有怎样的促进作用尚未研究清楚。对制剂分泌物的蛋白成分分析可促进我们对制剂性质的了解和对制剂的应用。

本研究主要利用shotgun LC-MS/MS结合生物信息学分析微生物MP制剂代谢产物的主要成分。结果显示，切割的9条胶条带共鉴定了35个非重复蛋白。这些蛋白的分子量均大于20 kD，等电点几乎都分布在4-7的范围内，主要是参与各类代谢途径以及蛋白降解的相关蛋白。

汪长国等人发现，喷施微生物MP制剂后烟叶中蛋白质的含量减少[1]。而我们鉴定MP制剂的代谢产物中有部分蛋白与蛋白降解相关，如氨基酰组氨酸二肽酶（Aminoacyl-histidine dipeptidase，PepD；EC 3.4.13.3）。该酶是金属蛋白酶家族M20的成员之一，大多数金属蛋白酶是Zn2+依赖酶，也有一些需要Mn2+、Co2+或者其他一些二价金属离子。PepD酶催化裂解并释放N末端氨基酸[12]，在蛋白成熟、降解、组织修复和细胞周期控制中具有重要作用[13]。嗜热菌状金属蛋白酶也与蛋白降解相关，能降解不同生物学上重要的物质，比如胶原质、纤维连接蛋白、纤维蛋白原等[14]。我们推测MP制剂的代谢产物中这些具有蛋白降解功能的蛋白可能在烟草采摘及烤制等过程中促使烟叶中蛋白质降解进而使得蛋白质含量降低，进而提高烟叶的品质。

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