羊奶乳清蛋白的分离方法研究

邵钺馨，曲赫选，钟玉玲，黄江涛，李雄龙，史怀平

（西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100）

近年来，随着人们对乳制品的认可，促使乳制品行业快速发展，对乳的营养研究不断深入。张志强等[1]研究表明，牛奶乳清蛋白占牛奶中蛋白质的20%；乳清中的钙含量占牛奶总钙的38%，磷含量占牛奶总磷的50%。在乳制品生产中，高质量的乳清粉可作为营养强化剂用于生产婴儿配方奶粉，同时乳清粉也被应用于羔羊犊牛代乳料、仔猪饲料的生产等，需求量呈逐年增加趋势。2017年我国乳清进口量达49.7万t[2]，与2007年相比增长近两倍，其中很大一部分用于饲料生产。随着乳清产品在市场上的广泛利用，乳清蛋白的提取效果越发受到关注。乳清蛋白有多种提纯方法，常见方法有乙醇分级沉淀法、等电点沉淀法、离心法、膜过滤法、CO2沉淀分离法，此外还有超临界CO2萃取法、双水相萃取法等，但以上方法提纯过程单一，对乳清蛋白的分离效果不甚理想。本研究根据羊奶蛋白的特性，对比分析了多种分离方法的处理效果，以期获得最佳乳清蛋白分离方法，提高乳清蛋白得率。

1 材料与方法

1.1 材料

羊奶采自西北农林科技大学萨能羊原种场。选择6只同质性良好的西农萨能奶山羊，在母羊产羔后第35天采集奶样进行分析。

1.2 方法

1.2.1 单一方法分离乳清

1.2.1.1 乙醇分级沉淀法

将一定体积的羊乳加入离心管中，添加占总体积20%的无水乙醇，搅拌均匀后放置1h过滤，去除沉淀物，保留上清液；然后在上清液中添加无水乙醇，使乙醇体积比例至35%，搅拌均匀；继续添加无水乙醇直至乙醇体积比值至55%，搅拌均匀。放置1h后4 000r/min离心，收集沉淀物分析。

1.2.1.2 等电点沉淀法

羊乳在3 000g、2℃条件下离心15min，弃去上层脂肪，制得脱脂乳；用1mol/L盐酸调脱脂羊乳pH至4.6，然后在5 000g、2℃条件下离心20min，收集上清液分析。

1.2.1.3 离心法

羊奶在17 800g、2℃条件下离心30min，然后弃去上层脂肪后收集上清液分析。

1.2.1.4 多种方法复合分离乳清

将上述3种分离方法经不同方式复合使用分离羊乳清，主要包括：①等电点法+乙醇法+离心法；②等电点法+离心法+乙醇法；③离心法+乙醇法+等电点法；④等电点法+乙醇法；⑤离心法+乙醇法；⑥离心法+等电点法；⑦离心法+等电点法+乙醇法；⑧乙醇法+等电点法；⑨乙醇法+离心法；⑩等电点法+离心法；乙醇法+等电点法+离心法； 乙醇法+离心法+等电点法。然后，对收集到的乳清进行分析，检验分离效果。

1.2.2 乳清纯度检测

1.2.2.1 羊奶乳清中总蛋白含量测定

提取羊奶乳清后，使用 BCA 蛋白浓度测量试剂盒（碧云天，P0012），以 0.9% NaCl 为空白，1.0mg/mL牛血清白蛋白（BSA）为标准，使用酶标仪测定OD值，分析羊奶乳清中总蛋白含量。之后，将分离得到的乳清总蛋白保存于-80℃备用。

1.2.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳

将提取的乳清蛋白与样品缓冲液混合后，沸水加热5min，进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳程序设置为100V、30min，之后转为140V、90min。电泳结束后对凝胶进行考马斯亮蓝G-250染色，之后脱色至背景透明，分析所得乳清蛋白的主要蛋白组分。

1.2.3 数据统计分析

运用GraphPad Prism 5.0对试验数据进行单因素方差分析，最终试验结果表示为“平均数±标准差”。

2 结果与分析

2.1 乳清中总蛋白分离效果比较

酪蛋白和乳清蛋白构成乳蛋白[3]。通过不同分离方法对羊奶乳蛋白进行分离，结果发现乙醇法、等电点法、离心法对羊奶乳清中总蛋白分离的效果有显著差异，其中离心法的效果最好，总蛋白浓度是15.706mg/mL，乳清中总蛋白得率是68.40%。上述三种方法不同方式配合使用后，发现“离心+等电点”配合使用总体效果较好，总蛋白浓度是10.226mg/mL，乳清中总蛋白得率是44.5%（见表1）。采用乙醇法分离的乳清中总蛋白得率明显偏低，与离心法或等电点法复合法相比分离得到乳清总蛋白浓度偏低，分离效果相对差。

表1 不同方法提取乳清的结果比较

2.2 乳清蛋白中的蛋白组分检测

奶样经SDS-PAGE电泳并通过imagej软件分析发现，乳清中α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白含量相对较高，但在不同分离法中差异明显。采用等电点、离心、离心+等电点、等电点+离心、离心+乙醇+等电点等分离法，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白条带明显，说明所获得的乳清中这两类蛋白组分含量高；但是，采用乙醇法、等电点+乙醇法、离心+乙醇法、离心+等电点+乙醇法、乙醇+等电点法、乙醇+离心法、乙醇+等电点+离心法、乙醇+离心+等电点法、等电点+乙醇+离心法、等电点+离心+乙醇法、等电点+离心+乙醇法等分离法，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白条带微弱，说明所获得的乳清中这两类蛋白组分含量少（图1）。进一步分析发现，山羊乳清中α-乳清蛋白含量低于β-乳球蛋白（图2）。

图1 SDS-PAGE电泳图

图2 不同乳清分离方法的β-乳球蛋白和α-乳清蛋白imagej灰度值

2.3 乳清中酪蛋白去除率检测

表2 不同分离方法的酪蛋白去除率

由表2可知，不同乳清蛋白分离方法所去除的酪蛋白含量差异显著。采用等电点法的酪蛋白去除率为48.5%，采用离心法酪蛋白去除率为25.9%，采用“离心法+等电点法”酪蛋白去除率为63.9%，采用“等电点法+离心法”酪蛋白去除率为48.4%，采用“离心+乙醇+等电点法”酪蛋白去除率为89.8%，可见，“离心法+等电点法”、“离心+乙醇+等电点法”获得的乳清纯度较好。

2.4 乳清中αs1-酪蛋白残留量检测

酪蛋白为乳蛋白的重要成分，占总蛋白含量的80%左右，其成分主要包括κ-酪蛋白、αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白和β-酪蛋白[3]。由于αs1-酪蛋白为过敏源，在接下来的试验中分析其在纯化乳清蛋白过程中的去除率。根据αs1-酪蛋白检测试剂盒说明，利用标准品绘制出标准曲线（图4），然后依据标准曲线计算样品中αs1-酪蛋白的浓度。结果发现，采用等电点法、离心法、“离心法+等电点法”、“等电点法+离心法”所获得的乳清中αs1-酪蛋白浓度分别为2.233mg/mL、2.233mg/mL、2.285mg/mL、2.460mg/mL，去除率分别达到16.90%、16.90%、14.90%、8.40%（表3）。从中可见，“等电点法+离心法”去除αs1-酪蛋白效果差。

图4 αs1-酪蛋白标准品线性回归曲线

表3 四种分离方法处理后的αs1-酪蛋白浓度

3 讨论

3.1 不同分离方法对乳清中总蛋白含量的影响

乙醇分级沉淀法在分离乳清蛋白时，蛋白共沉多且有局部变性，试验时间较长；等电点沉淀法虽然准确到位，但操作较复杂，pH值也不容易精确测定；离心法可定性或定量分析，但对试验仪器要求较高。这些方法虽然都可以将乳清蛋白分离，但是提纯过程都有不足。本试验中乙醇法分离乳清中总蛋白浓度偏低，边艳杰等[4]研究表明，加入乙醇裂解液抽提牛奶乳清中总蛋白，得到的总蛋白浓度为5.01mg/mL，分析其值低的原因，可能为部分蛋白加入乙醇等裂解液变形失活。本试验中，“离心法+等电点法”是将羊奶样品经均质处理后，用盐酸调节羊奶上清液的pH至4.6～4.7，然后进行静置，直至不再析出沉淀，于18～25℃条件下离心，离心的转速为≥17 000g，离心的时间≥0.5h，离心后弃去离心体系的上层脂肪和下层沉淀，吸取得到的清液为羊奶乳清总蛋白样品，用等电点沉淀法分离羊奶上清液中的酪蛋白，收集分离酪蛋白后的羊奶上清液，得到羊奶乳清蛋白。本试验中离心法得到的总蛋白浓度为（15.706±0.101）mg/mL，“离心+等电点”得到的总蛋白浓度为（10.226±0.240）mg/mL，“等电点+离心”得到的总蛋白浓度为（12.438±0.081）mg/mL，与陈静廷等[5]的研究结果相似，该研究在提取乳清蛋白时，调节牛奶乳清pH值为4.6，等电点沉淀提取法蛋白质质量浓度为（11.36±1.1）mg/mL。目前，国内外关于乳清蛋白分离方法的研究较少，尚未建立乳清蛋白提纯方法，现有研究多采用等电点沉淀分离乳清蛋白，复合法研究报道较少。

3.2 不同分离方法对乳清蛋白组分的影响

乳清蛋白包括β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、血清白蛋白等，还存在少量的乳铁蛋白、生长因子和乳过氧化物酶等成分[6,7]。乳清蛋白可以经过高温、磷酸化、酶水解等方法加工[8]，能够提高其乳化性，应用到食品、饲料等不同领域。王洁雯等[9]研究发现，乳清蛋白成分中α-乳清蛋白基本以单拷贝形式整合到宿主基因组中，是乳汁中酸性钙结合蛋白，且稳定遗传。杨怀荣等[10]利用高效液相色谱仪测定猪乳中乳清蛋白含量发现，α-乳清蛋白在分娩后含量逐渐上升，而β-乳球蛋白在第16天含量最低，为5.6mg/mL。本试验通过对不同分离乳清蛋白方法的探究发现，分离过程中会造成乳清蛋白成分的损失。张清勇等[11]研究表明，在当归中提取多糖时，乙醇能够改变当归多糖中蛋白质结构，从而提高多糖提取率。有研究表明，20%乙醇可沉淀球蛋白，40%乙醇可沉淀白蛋白。由本试验结果可看出，乙醇法对α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的含量影响最大。复合法中含乙醇法时分离效果均不理想。离心法较等电点法的乳清蛋白得率少，但两种方法复合使用时，β-乳球蛋白的得率高于50%。上述研究结果表明，为提高乳清生产价值，降低经济损失，应避免使用“乙醇法”，高效利用“离心法”或“等电点法”。

3.3 分离方法对酪蛋白残留量的影响

有研究表明，山羊奶中酪蛋白含量与牛奶中酪蛋白含量相似[12]；山羊奶中的αs1-酪蛋白含量比牛奶中低38.57%；山羊奶中的κ-酪蛋白和β-酪蛋白含量比牛奶中的κ-酪蛋白和β-酪蛋白含量高24.60%[13]。不同单体蛋白含量导致酪蛋白空间结构复杂不一[14]，造成分离羊奶乳清蛋白时酪蛋白的残余量不同。赵琦[15]研究表明，酪蛋白是以多种蛋白胶束方式存在，各种酪蛋白的稳定性、敏感性不同，造成了在分离乳清蛋白过程中酪蛋白残留的差异。张光驰[16]研究表明，酪蛋白胶束中磷酸钙的存在，增强了酪蛋白稳定性，当pH值低于6.8时，胶体磷酸钙开始溶解，pH值低于4.6时，酪蛋白沉淀溶解。朱玉英等[17]研究表明，采用等电点沉淀法，崂山奶山羊乳中酪蛋白的乳化稳定性较好，这可能与酪蛋白的pH值有关。在分离乳清过程中，乳球蛋白与酪蛋白之间发生复杂的化学反应，导致产生酪蛋白聚沉物[18]，影响酪蛋白残余量。杨勇等[19]研究表明，采用pH值为4.6缓冲液预先脱脂牛奶，沉淀酪蛋白的量约为0.611mg/mL。本试验中“等电点法”沉淀脱脂羊奶中酪蛋白含量约为0.675mg/mL，“等电点+离心法”沉淀脱脂羊奶中酪蛋白浓度为0.473mg/mL，进一步分析发现，在分离乳清蛋白过程中，离心法比等电点法的酪蛋白残余量多。

本试验中等电点法、离心法、“离心法+等电点法”、“等电点法+离心法”的αs1-酪蛋白去除率分别为16.90%、16.90%、14.90%、8.40%，αs1-酪蛋白的去除效果不显著，不能达到理想羊奶脱敏效果。αs1-酪蛋白残留量高的原因是，山羊乳中αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白等的相对分子质量都在20 000左右，为获得更多乳清蛋白是很难有效去除αs1-酪蛋白的；同时，κ-酪蛋白的等电点为5.3～5.8，β-酪蛋白的等电点为4.83～5.07[20]，故本试验采用pH值为4.6的等电点沉淀法去除乳清中酪蛋白也不能达到理想效果，因此αs1-酪蛋白残留量比较高。对此还需进一步探索，寻找出更好的解决办法。

4 结论

在多种羊奶乳清分离方法中，“离心法+等电点法”去除乳清中大量酪蛋白的同时，乳清蛋白得率高，明显保留了α-乳清蛋白和β-乳球蛋白，并且αs1-酪蛋白去除率相对高，是一种有效分离羊奶乳清蛋白的科学方法。