奶牛乳腺炎无乳链球菌的分离鉴定与耐药性分析

薛娇，刘康军，李建基，崔璐莹，孟霞，朱国强，王亨

(1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009 )

奶牛乳腺炎是奶牛四大疾病之一，不仅危害奶牛养殖业的发展，而且直接影响牛乳制品的品质，关系着人类的健康。据报道，我国奶牛乳腺炎的发病率大约为20%～70%，临床型乳腺炎的发病率为19.7%～55.6%，而隐性乳腺炎的发病率则高达61.03%～79.62%，给我国的奶牛养殖业带来了巨大的损失[1]。病原微生物感染是该病最主要的病因之一。引起乳腺炎的病原一共有80多种，其中比较常见的有葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、分枝杆菌等[2]。无乳链球菌不仅是常见的乳腺炎病原体，而且还是一种重要的人类病原体，可诱发新生儿、老年人和孕妇的侵袭性感染[3]。本研究旨在调查江苏地区和河北地区规模化奶牛场内无乳链球菌对一些常用抗生素的耐药情况，为奶牛场临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 奶样采集

在江苏地区和河北地区的奶牛养殖场中分别采集到55份和12份乳腺炎奶样。采样前先用温水洗净乳头并对其进行消毒处理，废弃前三把乳汁，严格按照无菌操作的要求采样，每个乳区采5～10mL，做好标记。奶样收集完成后置于冰盒中，立即送往实验室进行检测。

1.2 试剂用品

酵母提取物和胰蛋白胨，购自OXOID公司；氯化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉，购自SOLARBIO公司；质控标准品、甲酸和基质溶液，购自德国布鲁克公司；绵羊血由实验室采集，现采现用；革兰氏染液由实验室制备。

本试验中共使用12种标准药敏纸片，均购于杭州天和微生物试剂有限公司。具体药物名称以及含量等参照表1。

表1 药敏纸片含量及判定标准

1.3 试验方法

1.3.1 无乳链球菌的分离纯化

将奶样充分混匀，用灭菌接种环蘸取奶样在5%绵羊血琼脂平板上划线，37℃恒温培养24h。观察菌落形态以及溶血特性，挑取可疑菌落进行纯培养和革兰氏染色镜检。

1.3.2 无乳链球菌的MALDI Biotyper系统鉴定

每种微生物都有其自身独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。MALDI Biotyper系统就是通过检测微生物的蛋白质指纹谱图来鉴定微生物[4]。具体方法是：挑取单个菌落涂抹于MALDI靶板上，并加入1µL质控标准品用于质量校准和仪器参数优化。在单菌落涂层上加入1µL 70%的甲酸水溶液。最后在靶板上加入1µL基质溶液，自然干燥后放入质谱仪内，筛选出特异性的指纹图谱，与数据库进行比对鉴定细菌。

1.3.3 药物敏感性试验

用无菌接种环挑取单个菌落，在血琼脂平板上均匀划线，并放置药敏纸片，置于37℃恒温箱中培养，24h后测定抑菌圈直径，根据相关标准判断细菌对药物的敏感性。

2 结果

2.1 无乳链球菌的分离鉴定

2.1.1 在血琼脂平板上的生长情况

无乳链球菌在5%绵羊血琼脂上生长成圆形、光滑凸起、湿润、边缘整齐的灰白色针尖大小的菌落（图1）。

图1 无乳链球菌在血琼脂平板上的生长情况

2.1.2 染色结果

挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下可见其被染成紫色，呈链状排列（图2）。

图2 无乳链球菌的染色结果（革兰氏染色、10×100）

2.1.3 鉴定结果

使用MALDI Biotyper系统对奶样中分离出的菌株进行鉴定，共检出33株无乳链球菌，其分离率为49.3%。图3为其质谱峰图。

图3 无乳链球菌质谱峰图

2.2 药物敏感性试验结果

对从河北以及江苏地区某奶牛场分离出的33株无乳链球菌进行药敏试验，结果显示：河北地区某奶牛场分离株对阿莫西林、青霉素、多西环素、头孢氨苄以及恩诺沙星高度敏感，敏感率均超过80%，对四环素和克林霉素比较敏感，敏感率分别为50.0%和66.7%，对链霉素、庆大霉素、卡那霉素以及丁胺卡那产生了严重的耐药性。江苏地区分离株对阿莫西林、头孢氨苄和恩诺沙星具有较高的敏感性，其中对头孢氨苄和恩诺沙星的敏感率均高达96.3%，对青霉素和环丙沙星比较敏感，但对四环素、链霉素、庆大霉素、多西环素、卡那霉素和丁胺卡那耐药，这几种药物的耐药率分别为：74.1%、100.0%、85.2%、74.1%、81.5%和100.0%。无乳链球菌对药物的敏感与耐药情况见表2。

表2 药敏试验结果

3 讨论

无乳链球菌是奶牛乳腺炎最主要的病原体之一。无乳链球菌感染乳腺主要有两种方式：一种是进入乳头感染乳腺组织，另一种是从伤口进入机体后在血液中大量繁殖，随血流到达乳腺。细菌感染乳腺后可在细胞中迅速生长繁殖，损伤乳腺导管以及上皮细胞，并造成乳腺导管的堵塞，使小叶和腺泡发生病理改变，最终导致奶牛丧失泌乳功能[5]。无乳链球菌属于接触性感染菌，主要通过挤奶设备和操作传播扩散[6]。本试验中，江苏地区无乳链球菌分离率为49.1%，河北地区的分离率为50.0%。该结果显著高于刘春杰等人报道的长春地区8.2%的无乳链球菌分离率[7]，表明乳腺炎的病原菌具有地区差异性，并且与每个养殖场的环境卫生情况有着直接的关系。本次试验中所涉及的河北地区和江苏地区的奶牛场在挤奶设备以及操作上可能存在一定的安全隐患。

目前对于乳腺炎的治疗主要以抗生素为主，但抗生素的长期使用易导致细菌产生耐药性。本试验对分离到的33株无乳链球菌进行了药物敏感性试验，发现河北地区和江苏地区奶牛场分离出的无乳链球菌的耐药情况有一些相似之处。比如：两地的无乳链球菌对β-内酰胺类药物中的阿莫西林、头孢氨苄以及喹诺酮类药物如恩诺沙星等药物高度敏感，这与杜琳、周雪等人报道的华北地区无乳链球菌的敏感情况相一致[8]，并且与保加利亚学者Decheva的研究结果相同[9]。说明β-内酰胺类以及喹诺酮类药物可以作为这两个地区的奶牛场治疗乳腺炎的主要药物。河北以及江苏地区分离的无乳链球菌对克林霉素比较敏感，敏感率分别为66.7%和37.0%，低于易明梅等人报道的上海地区的无乳链球菌对克林霉素的敏感率[10]。两个地区的分离株对链霉素、庆大霉素、卡那霉素以及丁胺卡那这四种氨基糖苷类药物均表现出较高的耐药性，这一结果与芮萍等人对河北地区耐药性的报道有较大出入[11]，可能是不同养殖场饲养管理情况不同引起。另外，两个地区奶牛场无乳链球菌分离株的耐药情况也存在着一定差异。河北地区分离株对四环素、多西环素比较敏感，但在江苏地区表现出了较强的耐药性（均高达74.1%）。这可能是因为这两个地区用药种类和方法不同，在江苏地区四环素类药物使用的比较多，因此产生了较强的耐药性。药敏试验结果提示：氨基糖苷类药物耐药情况较严重，已不能作为这两个地区奶牛场治疗乳腺炎的主要药物，而环丙沙星和恩诺沙星等新型喹诺酮类药物以及β-内酰胺类药物抑菌效果较好，对乳腺炎的治疗有一定效果。

临床上在治疗乳腺炎时应定期进行药敏试验，根据药敏试验结果科学合理地使用抗菌药物，避免长期过量使用同一种抗生素。使用抗生素时，应严格掌握适应症和用药指征，剂量要够，疗程要恰当，不滥用抗生素。发现耐药菌株时，应改用对病原菌敏感的药物或采取联合用药。奶牛乳腺炎主要以预防为主，防重于治。创建完善的奶牛饲养管理制度，改善牛舍环境卫生、训练挤奶员按规范程序操作和提高挤奶熟练度是降低乳腺炎发生率的重要措施[12]。目前越来越多的人开始研究更有效的防治方法，如通过营养调控改善机体的防御机能，应用中草药作为佐剂增强抗生素或者抗菌素的效果、降低耐药性等。