清开灵注射液对小鼠脾T、B细胞增殖的影响*

邢恩鸿，邵雪斋，王旭丹，王 睿，张 丽△

(1.承德医学院附属医院，河北承德 067000;2.北京中医药大学免疫学教研室;3.北京理工大学)

清开灵注射液对小鼠脾T、B细胞增殖的影响*

邢恩鸿1，邵雪斋1，王旭丹2，王 睿3，张 丽2△

(1.承德医学院附属医院，河北承德 067000;2.北京中医药大学免疫学教研室;3.北京理工大学)

目的:研究清开灵注射液(QKL)在体外对小鼠脾T、B细胞增殖活化的影响。方法:常规制备小鼠脾细胞，观察T细胞转化实验加ConA，观察B细胞转化实验加LPS。采用MTT法观察不同浓度QKL对小鼠脾T、B细胞增殖活化的作用。结果:不同浓度的QKL(1/3200及以上)对脾B细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性(P＜0.01)。高浓度QKL(1/400及以上)对脾T细胞增殖具有抑制作用，低浓度QKL(1/800以下)对脾T细胞增殖具有促进作用(P＜0.01)。结论:QKL可通过影响T、B细胞的活化增殖调节机体的免疫反应。

清开灵注射液;脾;T细胞;B细胞;细胞增殖

清开灵注射液(QKL)是在古方“安宫牛黄丸”的基础上，精选多种中药研制而成的一种纯中药复方制剂，具有清热解毒、化痰通络、镇惊安神、醒神开窍等功效。在临床上主要用于治疗感染性疾病、脑血管疾病、传染性疾病和自身免疫性疾病等[1-3]。随着QKL临床应用范围的扩大，有关其治疗机制的研究亦日趋深入，但主要集中于脑血管疾病、感染、发热性疾病等方面，对QKL免疫调节作用机制的研究较少[4-6]。为此，本研究探讨了QKL在体外对小鼠脾T、B细胞体外活化、增殖的影响，以期为QKL在临床上治疗免疫相关性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与试剂 QKL，北京中医药大学药厂;LPS、ConA、甲基偶氮唑盐(MTT)，美国Sigma公司;RPMI-1640培养液，美国Gibco公司。动物:清洁级雌性C57Bl/6小鼠，体重18-20g，北京维通利华实验动物中心，合格证号:SCXK(京)2002-0003。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴细胞悬液的制备:断颈处死小鼠，无菌分离脾脏，置不完全1640培养液中，用50目钢网研磨制成单个细胞悬液，1500r/min离心5min，弃上清。沉淀用双蒸水(低渗法)破坏红细胞，双盐水恢复等渗后，200目尼龙网过滤，1500r/min离心5min后弃上清。收集细胞，冷PBS洗涤2次，用完全1640培养液调整细胞浓度为5×106/ml。

1.2.2 淋巴细胞培养:将密度为5×106/ml的淋巴细胞悬液接种于96孔板，每孔100μl，观察T细胞转化实验加ConA，终浓度为5☒g/ml;观察B细胞转化实验加LPS，终浓度为50☒g/ml。同时设单纯1640培养液细胞对照孔。加入不同稀释度的QKL，设1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400八个稀释度，分别将100☒l不同稀释度的QKL加入板中，每个稀释度设8个复孔。培养板置于37℃、5% CO2培养箱中孵育72h。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖:培养结束前4h每孔加入MTT溶液20μl后继续培养，培养结束后培养板3000r/ min离心5min，弃上清，用滤纸吸去水分后，每孔加入酸化异丙醇100μl，静置15min，轻轻混匀后，492nm波长检测OD值。

1.3 统计分析 采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

小鼠脾细胞在ConA刺激72h后，OD值为0.405± 0.044，与单纯1640培养液(0.073±0.007)比较，脾T细胞明显增值活化(P＜0.05);LPS刺激72h后，OD值为0.612±0.025，与单纯1640培养液(0.125±0.019)比较，小鼠脾B细胞增值活化明显(P＜0.05)。

QKL对小鼠脾B细胞增殖有明显的抑制作用，除1/ 6400 QKL与LPS对照比较差异无统计学意义外，从1/3200 QKL即开始显示出明显的抑制作用，且呈明显的剂量依赖性(P＜0.01)。见附表。

QKL对小鼠脾T细胞的增殖表现出高浓度抑制、低浓度促进的作用。QKL稀释度为1/800到1/3200时，表现出明显的促T细胞增殖的作用，且呈剂量依赖性(P＜0.01);QKL的浓度增大至1/400以上时，表现出对T细胞增殖明显的抑制作用(P＜0.01)。见附表。

附表 QKL对小鼠脾T、B细胞增殖的影响(OD值，±s)

附表 QKL对小鼠脾T、B细胞增殖的影响(OD值，±s)

与1640培养液比较:#P＜0.05;与T或B细胞对照比较:P＜0.01

组别 B细胞 (492nm) T细胞(492nm) 1640培养液 0.125±0.019 0.073±0.007 LPS对照 0.612±0.025# -ConA对照 - 0.405±0.044#50-1清开灵 0.137±0.017* 0.078±0.008*100-1清开灵 0.263±0.026* 0.092±0.0007*200-1清开灵 0.474±0.091* 0.174±0.016*400-1清开灵 0.457±0.040* 0.324±0.023*800-1清开灵 0.484±0.038* 0.480±0.037*1600-1清开灵 0.486±0.034* 0.538±0.023*3200-1清开灵 0.519±0.040* 0.520±0.051*6400-1清开灵 0.614±0.034 0.454±0.071

3 讨论

T、B细胞是机体执行适应性免疫应答的主要免疫细胞。B细胞不仅能通过产生抗体发挥特异性体液免疫功能，也是重要的抗原提呈细胞。T细胞具有高度异质性，可分为不同的亚群，各亚群之间相互调节，共同发挥免疫功能;T细胞除可介导适应性细胞免疫应答，在胸腺依赖抗原诱导的体液免疫应答中也发挥重要的辅助作用[7]。

免疫应答可分为固有性免疫应答与适应性免疫应答，二者相辅相成、密不可分。适应性免疫是机体对抗内源性与外源性“非己”成分的最终屏障，并且其效应分子可大大促进固有免疫应答，免疫病理及免疫性相关疾病的发生均与适应性免疫应答过程异常有关。适应性免疫应答可分为三个阶段:识别阶段、活化增殖阶段和效应阶段。在识别阶段，T、B细胞分别通过TCR与BCR精确识别抗原;在活化增殖阶段，识别抗原后的淋巴细胞在协同刺激分子的参与下，细胞发生活化、增殖和分化，产生效应细胞、效应分子和记忆细胞;最后是效应阶段，效应细胞和效应分子清除抗原。因此，调节T、B细胞的活化增殖可作为理想的免疫干预措施。

本研究应用MTT法观察QKL在体外对T、B细胞活化增殖的影响。结果显示，ConA刺激72h、LPS刺激72h，小鼠脾T细胞、B细胞分别明显增殖活化;加入不同浓度的QKL后，1/3200浓度的QKL对脾B细胞即有明显的抑制增殖作用，且抑制作用呈明显的剂量依赖性。有文献报道，QKL可明显降低ConA刺激的脾T细胞的增殖指数，且呈一定的浓度依赖性[8]。但本研究发现，高浓度(1/400及以上)QKL对T细胞增殖具有抑制作用，低浓度(1/800及以下)QKL对T细胞增殖具有促进作用。因此表明，QKL是一种有效的免疫调节剂，其治疗自身免疫性疾病的机制可能是通过影响T、B细胞的活化增殖调节机体的免疫反应。

[1]傅红英.清开灵联合抗生素治疗慢性支气管炎急性发作40例[J].浙江中医杂志，2010，45(6):423.

[2]陈伟，袁媛，何龙泉，等.清开灵注射液对高血压脑出血全身炎性反应综合征的干预作用[J].中医药临床杂志，2005,17(5):463-464.

[3]刘德芳，郭明阳，刘太华，等.注射用清开灵联合中药治疗类风湿关节炎活动期的临床研究[J].中国医院用药评价与分析，2009，9(1):64-66.

[4]庞春红，李澎涛，朱晓磊.缺血-再灌注相关细胞因子表达的 TNF -α损伤机制及清开灵的作用[J].世界中医药，2011，6(4):343-346.

[5]曹春雨,梁爱华,赵雍，等.清开灵注射液的抗血栓作用及其机制研究[J].中国中药杂志，2009，34(12):1549-1550.

[6]黄良胜.清开灵注射液解热抗炎作用的实验研究[J].临床合理用药，2012，5(1C):6-7.

[7]金伯泉，熊思东.医学免疫学[M].第5版.北京:人民卫生出版社，2009.122-133.

[8]赵令斋，曾耀英，黄秀艳，等.清开灵注射液对小鼠T细胞行为和DTH的影响[J].中山大学学报(医学科学版)，2008，29(4):407-411.

INFLUENCE OF QINGKAILING INJECTION ON PROLIFERATION OF MOUSE SPLEEN T AND B LYMPHOCYTES

XING En-hong, SHAO Xue-zhai, WANG Xu-dan, et al
(The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To study the inf l uence of Qingkailing injection (QKL) on proliferation of mouse spleen T and B lymphocytes in vitro.Methods:Concanavalin A was added to mouse spleen lymphocytes to activate T lymphocytes and LPS to activate B lymphocytes. MTT method was used to observe the effects of QKL of different concentration on mouse spleen T and B lymphocytes proliferation.Results:QKL of different concentration (1/3200 and above) could obviously inhibit proliferation of spleen B lymphocytes, and showed dose dependent (P＜0.01). High concentration QKL (1/400 and above) could inhibit proliferation of spleen T lymphocytes, while low concentration QKL (below 1/800) could promote proliferation of spleen T lymphocytes (P＜0.01).Conclusions:QKL can regulate immune reaction by inf l uencing the proliferation of T and B lymphocytes.

Qingkailing injection; Spleen; T lymphocytes; B lymphocytes; Cell proliferation

R285.5

A

1004-6879(2013)01-0003-03

2012-06-10)

* 承德市科技发展计划项目(200922070)

△ 通讯作者