旋毛虫小鼠小肠和肌肉组织Caspase-3蛋白表达的研究

李 丹，常红敏，赵 蕾，邴玉艳，陈晓宁，杜娈英

(承德医学院，河北承德 067000)

旋毛虫小鼠小肠和肌肉组织Caspase-3蛋白表达的研究

李 丹，常红敏，赵 蕾，邴玉艳，陈晓宁，杜娈英△

(承德医学院，河北承德 067000)

目的:观察旋毛虫小鼠小肠组织和肌肉组织Caspase-3蛋白表达的变化。方法:建立河南株旋毛虫感染小鼠模型，取3、5、7d成虫期小鼠小肠组织，4、5、6w幼虫期小鼠肌肉组织。采用Western Blot法检测小鼠小肠组织和肌肉组织Caspase-3蛋白的表达情况。结果:旋毛虫成虫发育过程中，小鼠小肠组织Caspase-3蛋白的表达随感染时间的延长升高(P＜0.05);旋毛虫幼虫发育过程中，感染5w小鼠肌肉组织Caspase-3蛋白的表达水平最高(P＜0.05)。结论:旋毛虫感染可致小鼠小肠组织和肌肉组织Caspase-3蛋白的表达水平升高，且与感染时间有关。

旋毛虫;成虫;幼虫;Caspase-3

旋毛形线虫(Trichinella spiralis)简称旋毛虫，成虫和幼虫分别寄生于同一宿主的小肠和肌肉组织，导致的旋毛虫病(trichinellosis)是一种严重的人兽共患寄生虫病，呈全球性分布，并被列为三大人兽共患寄生虫病之首(旋毛虫病、囊虫病及棘球蚴病)[1]。近年来，我国已发生多起旋毛虫病爆发流行[2-3]。旋毛虫成虫入侵肠壁组织和幼虫入侵宿主肌肉组织都是其发育过程中的重要阶段，但相关机制尚不十分清楚。本研究采用Western Blot法检测旋毛成虫期小鼠小肠组织、幼虫期肌肉组织，随感染时间的延长凋亡因子Caspase-3表达的变化情况，探讨旋毛虫成虫在小肠内寄生、幼虫侵入肌肉组织时引起侵袭部位的细胞凋亡情况，为研究旋毛虫病的发病机制及药物治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 旋毛虫株(河南株)由承德医学院病原生物学教研室小鼠传代保种。实验用昆明雄性健康成年小鼠，体重20-25g，购自承德医学院实验动物中心。主要试剂:胃蛋白酶(1:3000)，上海生工生物工程有限公司;兔抗Caspase-3抗体，美国Sigma公司;β-actin，上海康成生物工程有限公司;辣根过氧化物酶标记的二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司;组织细胞裂解液，江苏海门碧云天生物技术研究所;BCA蛋白浓度检测试剂盒，北京普利莱公司。

1.2 实验分组 80只小鼠随机分为A组(成虫期)和B组(幼虫期)，每组40只。A组随机分为感染旋毛虫3、5、7d组及正常对照组，每组10只;B组随机分为感染旋毛虫4、5、6w组及正常对照组，每组10只。

1.3 动物模型的建立[4-5]取河南株保虫小鼠一只处死，取部分膈肌压片，镜下观察有无旋毛虫感染，全身骨骼和肌肉称重，纯水冲洗至没有污血，剪刀剪碎后用组织捣碎机充分捣碎，按1:20的比例加入人工消化液，37℃水浴消化5h，生理盐水洗涤含旋毛虫幼虫的沉淀6次，加入适量4%的明胶溶液充分混匀，取50☒l混悬液，镜下计数幼虫，调整混悬液中的幼虫密度至200条幼虫/0.2ml，用于感染昆明小鼠，建立动物模型。

1.4 取材及Western Blot检测 分别取感染3、5、7d旋毛虫小鼠十二指肠和感染4、5、6w旋毛虫小鼠腓肠肌，冰生理盐水清洗后入液氮速冻，然后移入-80℃冰箱保存。取冷冻保存的小肠和肌肉组织，预冷PBS冲洗2次后，冰浴条件下用细胞裂解液裂解细胞，BCA蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白质浓度。12%分离胶和5%浓缩胶电泳，蛋白上样量10μg;4℃转膜2h，5% BSA常温封闭2h，一抗(1:1000)4℃孵育过夜，二抗(1:5000)摇床孵育1h;加入增强型化学发光剂(ECL)，X线胶片曝光、显影和定影。采用Quantity One软件对显影条带进行分析，分别计算Caspase-3条带与β-actin条带的灰度比值，作为目的蛋白的相对表达水平。

1.5 统计分析 采用SPSS 17.0统计软件分析数据，数据用(±s)表示，多组间比较行方差分析，以α=0.05为显著性检验的水准。

2 结果

2.1 旋毛虫小鼠小肠组织Caspase-3蛋白的表达 旋毛虫感染各组Caspase-3蛋白的表达均明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。旋毛虫成虫发育过程中，小鼠小肠组织Caspase-3蛋白的表达随感染时间的延长升高;不同感染时间比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图1、表1。

图1 旋毛虫小鼠小肠组织Caspase-3的表达

表1 旋毛虫小鼠小肠组织Caspase-3蛋白的表达(±s)

表1 旋毛虫小鼠小肠组织Caspase-3蛋白的表达(±s)

与正常对照组比较:aP＜0.05;与感染3d组比较:bP＜0.05;与感染5d组比较:cP＜0.05

组别 例数 Caspase-3表达量正常对照组 10 0.793±0.027感染3d 10 0.857±0.025a感染5d 10 1.040±0.018ab感染7d 10 1.344±0.023abc

2.2 旋毛虫小鼠肌肉组织Caspase-3蛋白的表达 旋毛虫感染各组Caspase-3蛋白的表达均明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在旋毛虫幼虫发育过程中，感染5w组明显高于感染4w、6w组，感染6w组明显高于感染4w组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图2、表2。

图2 旋毛虫小鼠肌肉组织Caspase-3的表达

表2 旋毛虫小鼠肌肉组织Caspase-3蛋白的表达(±s)

表2 旋毛虫小鼠肌肉组织Caspase-3蛋白的表达(±s)

与正常对照组比较:aP＜0.05;与感染4w组比较:bP＜0.05;与感染5w组比较:cP＜0.05

组别 例数 Caspase-3表达量正常对照组 10 0.232±0.023感染4w 10 0.312±0.015a感染5w 10 0.541±0.026ab感染6w 10 0.360±0.035abc

3 讨论

旋毛虫寄生于猪、野猪、鼠、熊等多种动物及人体内，因生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉或其它动物肉类感染。近年来，旋毛虫的感染率有增高的趋势[6]。旋毛虫成虫主要寄生于宿主的十二指肠和空肠上段，以肠绒毛为食，虫体分泌ES产物，引起十二指肠和空肠局部充血、水肿、灶性出血，甚至发生浅表溃疡。含幼虫的囊包则寄生于同一宿主的横纹肌细胞内，幼虫侵入肌肉时，肌纤维遭到严重破坏，表现为肌纤维肿胀、横纹消失、间质有轻度水肿和不同程度的炎性细胞浸润，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞。上述发病机制说明旋毛虫进入宿主的小肠和肌肉组织可造成组织的功能障碍和结构损伤，但并未阐明旋毛虫成虫和幼虫以何种方式造成这些损伤。过去的认识主要局限于旋毛虫对宿主的机械性损伤，目前已有研究证实细胞凋亡在寄生虫和宿主相互的作用中具有重要作用，但细胞凋亡在旋毛虫和宿主相互作用中的研究较少[7-9]。

Caspase家族是近年来新发现的一类半胱氨酸蛋白酶，具有特异酶切天冬氨酸氨基位点的特征，是细胞凋亡过程中最重要的终末剪切酶，一旦被激活，凋亡常难以避免。Caspase-3是介导细胞凋亡的一类蛋白水解酶，在细胞凋亡过程中处于核心位置，凋亡的最后实施通过激活Caspase-3实现，因此,组织内Caspase-3表达增多提示有大量的细胞凋亡[10]。本研究结果显示，感染旋毛虫3d、5d和7d的成虫期小鼠小肠组织Caspase-3的表达逐渐增高，表明成虫期小鼠小肠组织的凋亡水平随旋毛虫感染时间的延长逐渐增加。本研究亦发现，旋毛虫小鼠幼虫期发育过程中，第4w、5w时Caspase-3蛋白的表达明显升高，第6w时Caspase-3蛋白的表达明显下降。小鼠感染旋毛虫第4w、第5w幼虫侵入肌肉初期，幼虫生长速度快，对肌肉组织的机械性损伤加大，因此细胞凋亡明显;第6w幼虫周围逐渐形成囊包，生长速度变慢，对肌肉组织的损伤亦减小，Caspase-3的表达降低，细胞凋亡有所下降。这一结果与李继红[11]的研究结果一致。

本研究观察了旋毛虫小鼠小肠组织和肌肉组织Caspase-3蛋白的表达情况，发现旋毛虫成虫期和幼虫期生长发育旺盛阶段Caspase-3蛋白的表达水平较高。本研究可为旋毛虫发病机制的研究提供实验基础，关于旋毛虫通过何种途径诱导细胞凋亡有待进一步研究。

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[4]赵雪，申丽洁.不同时龄旋毛虫新生幼虫的体外培养和收集方法研究[J].中国病原生物学杂志，2008，3(9):697-698.

[5]杨维平，吴中兴.人体寄生虫病化学药物防治[M].南京:东南大学出版社，2004.416-417.

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[7]刘永杰，李庆章，郝艳红.猪囊尾蚴发育过程中的细胞凋亡[J].中国人兽共患病杂志，2003，19(1):84-85.

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STUDY ON CASPASE-3 PROTEIN EXPRESSION IN SMALL INTESTIN AND MUSCLE TISSUE OF TRICHINELLA SPIRALIS MICE

LI Dan, CHANG Hong-min, ZHAO Lei, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To observe the changes of Caspase-3 protein in small intestine and muscle tissue of trichinella spiralis mice.Methods:Henan strain trichinella spiralis infected Kunming mice model was established, and Caspase-3 protein expression were detected in small intestine (infected 3d, 5d and 7d) and muscle tissue (infected 4w, 5w and 6w) respectively.Results:With extension of infection time, the expression of Caspase-3 protein in small intestine increasedduring developmental process of trichinella spiralis adult (P＜0.05). The expression of Caspase-3 protein in muscle tissue of infected 5w was the highest during developmental process of trichinella spiralis larvae (P＜0.05).Conclusions:Trichinella spiralis infection can cause increasing of Caspase-3 protein expression in small intestine and muscle tissue of mice, moreover has relations with infection time.

Trichinella spiralis; Adult; Larvae; Caspase-3

S855.9

A

1004-6879(2013)01-0007-03

2012-08-28)

△ 通讯作者