FASN靶向miRNA干扰质粒的构建及鉴定

曾会龙 罗庆丰 刘志礼 詹名花 张志宏 陈文昭 龙新华

近年来，研究表明FASN在多种恶性肿瘤细胞中呈现过表达［1-3］，且FASN表达改变在肿瘤的侵袭转移过程中可能扮演着重要角色［4-5］。MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类长约20～25个核苷酸的具有调控功能的非编码RNA，在细胞的生长、分化、增殖、凋亡过程中起重要作用［6］。本研究构建靶向抑制FASN基因表达的miRNA重组质粒，检测其对FASN在人骨肉瘤细胞U2-OS细胞中的表达，为进一步研究FASN基因在骨肉瘤侵袭转移中的作用及机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

U2-OS细胞株购自上海中科院细胞库;LipofectamineTM2000和质粒 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体购自invitrogen公司;质粒小提试剂盒购自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 设计与合成miRNA寡聚单链DNA序列 根据NCBI查询到人FASN蛋白的编码基因FASN的cDNA序列(NM_004104.4)，设计合成4对miRNA和1对阴性对照寡聚单链DNA(表1)。

1.2.2 质粒构建与测序 将寡聚单链DNA退火成双链，载体构建试剂盒进行重组克隆，将4对双链的miRNA oligos分别克隆到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，构建4个miRNA质粒(简称X197-1、2、3、4)并转化至感受态细胞 DH5α，摇菌抽提质粒后进行测序。

1.2.3 人骨肉瘤U2-OS细胞转染 U2-OS细胞用含10%FBS的DMEM/F12培养基(Hyclone)置于5%CO2、37℃条件下培养，按Lipofectamine 2000转染说明书进行转染，以质粒(μg):脂质体(μl)为1∶3转染人骨肉瘤细胞U2-0S，24 h后观察荧光。荧光率是指在荧光显微镜下计算20个高倍视野的荧光细胞数占视野细胞总数的百分比。

1.2.4 PCR检测 FASN mRNA的表达 转染48 h后用TRNzol(北京天根生化)提取总RNA。按逆转录试剂盒说明书把RNA逆转录成cDNA。FASN上游引物5＇-ATTCCGGGCCAAGTTCTAC-3＇，下游引物 5＇-GCGCATGTACAGCTCG TG-3＇，扩增产物长 294 bp;β-actin为内参，扩增产物长443 bp。相对抑制率(%)=(对照组-干扰组)/对照组×100%。

1.2.5 Western blot检测 FASN蛋白的表达 转染48 h后提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取15 μg蛋白样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳，转膜5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h，一抗为兔抗人FASN多克隆抗体(1∶1000)和鼠抗人 β-actin单抗(1∶1000)，分别加辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1∶5000)孵育。相对抑制率(%)=(对照组-干扰组)/对照组×100%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miRNA真核表达载体的测序

测序结果表明，所获得的重组干扰质粒目的片段与预期的完全相符，表明退火形成的干扰寡核苷酸成功并正确连接入pcDNA6·2-GW/EmGFP-miR载体(图1)。

2.2 重组质粒转染U2-OS细胞效率

荧光显微镜观察发现，转染24 h后有较多细胞出现绿色荧光(图2A、B、C、D)。4种质粒转染U2-OS细胞的荧光率，其中X197-1荧光率＞60%，X197-2荧光率＞50%，见图2E。

2.3 重组质粒对FASN mRNA和FASN蛋白表达的影响

构建的4种质粒均下调了U2-OS细胞内FASN mRNA表达水平(图3A)。4种质粒的FASN mRNA相对抑制率显著低于对照组(P＜0.05)，其中以质粒X197-1、X197-4最为显著，见图3B。

构建的4种质粒均下调了U2-OS细胞内FASN蛋白表达水平(图3C)。4种质粒FASN/β-actin灰度值比提示4种质粒均能有效抑制FASN蛋白表达，其中以X197-1抑制作用最强，见图3D。

图1 shRNA测序图

图2 重组质粒转染U2-OS细胞荧光图(×200)

3 讨论

研究表明除哺乳期的乳腺和周期性的子宫内外，FASN在正常组织中低水平表达，但是在多种恶性肿瘤细胞中过度表达，我们前期研究也证实FASN在骨肉瘤中呈高表达［7］。Murata 等［4］和 Carvalho 等［8］发现FASN活性下降能减少结肠癌的肝转移和黑色素瘤细胞的转移扩散。我们前期研究证实FASN在骨肉瘤组织中高表达，并发生肺部转移的组织中表达水平显著高于未发生转移组织中的水平［9］，并且FASN特异性抑制cerulenin能在体内外诱导U2-OS细胞凋亡，而抑制其增殖［10］。上述均强烈提示FASN基因有望成为骨肉瘤治疗的分子靶点，但是能否成为骨肉瘤转移治疗的靶点有待研究。

图3 重组质粒转染U2-OS后对FASN表达的抑制

pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR是一个同时带有杀稻瘟菌素抗性和GFP标签的真核表达载体，一方面可以利用杀稻瘟菌素筛选出稳定转染细胞，另一方面GFP表达出绿色荧光蛋白可以用以确定转染效率，是RNAi技术中重要的研究工具。本研究应用新一代BLOCK-iTTMPol II miR RNAi技术，以 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体，针对人FASN基因的cDNA序列构建FASN干扰质粒，通过脂质体法转染人骨肉瘤细胞U2-OS。Western blot和RT-PCR结果显示，本研究所构建的质粒均能有效的抑制FASN表达，说明构建的质粒完全达到有效干扰目的基因表达的要求，为进一步研究FASN对骨肉瘤细胞迁徙、侵袭的影响及机制奠定了基础。

本研究成功构建了靶向FASN基因的miRNA干扰质粒，为进一步研究FASN对骨肉瘤细胞迁徙、侵袭的影响及机制奠定了基础。

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