重楼皂苷对兔眼角膜B16恶性黑色素瘤细胞的抗肿瘤活性

兰海涛 曲 超 刘显波 吴 琦

在中国传统医学中，重楼(Rhizoma Paridis)常被组成方剂用于癌症的治疗。现代药理学研究发现重楼对多种肿瘤细胞均有抑制作用，而皂苷(saponins)是其主要药效成分［1-3］。目前临床上多以顺铂等铂类为基础的联合化疗来治疗多种实体肿瘤［4-5］。本研究应用B16鼠恶性黑色素瘤细胞兔眼角膜层间注射构建的动物肿瘤模型，观察重楼总皂苷对兔眼角膜B16恶性黑色素瘤细胞的抗肿瘤作用，进一步了解重楼皂苷在体内的抗肿瘤活性，为临床新药的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物

由四川大学华西药学院生药教研室完成重楼皂苷化学成分的分离鉴定工作，提取得到滇重楼皂苷。顺铂溶于生理盐水浓度为10 mmol/L，此浓度相当于临床化疗体内药物峰值浓度。

1.2 B16鼠恶性黑色素瘤细胞肿瘤动物模型

1.2.1 B16混悬液的配置 B16鼠黑色素瘤细胞株购自上海细胞生物研究所，由我院分子遗传实验室冻存备用。细胞复苏后，常规培养于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的1640培养液中，置于5%CO2培养箱，37℃培养。对数增殖期细胞经0.25%胰酶消化，收集于无血清的培养液中，轻轻摇动，细胞悬液经计数浓度为5×106/ml。锥虫蓝染色，检测细胞活力在95%以上。

1.2.2 兔角膜层间B16细胞的接种 大耳白兔兔匣固定，蓓诺喜眼液表面麻醉3～5次。左手持有齿显微镊，固定结膜;右手用胰岛素注射针，刺入角膜层间，刺入点距离角膜中心2～3 mm，在角膜层间前行，推注20 μl B16 混悬液。

1.3 动物实验

日本大耳白兔18只，雌雄各半，体重在2.0～2.5 kg，来自四川省人民医院动物房。B16细胞兔眼角膜接种7 d后分为3组，分别应用重楼皂苷(250 μg/ml，重楼皂苷组)，顺铂(对照组)和生理盐水(空白对照组)，于第7、14、21、28天进行角膜层间注射给药，瘤区多点注射。

1.4 裂隙灯观察和色素记录

大耳白兔兔匣固定，表面麻醉后，应用裂隙灯显微数字图像处理系统进行照相，观察B16色素细胞生长过程。应用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)计算黑色素面积，代表肿瘤生长情况。分别于接种当天、第7、14、21、28天裂隙灯显微镜下观察肿瘤生长。

1.5 统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件分析，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

三组实验动物注药第7、14、21及28天时肿瘤的生长情况见图1～图3:可见空白对照组黑色素瘤细胞的生长随时间延长呈明显增长趋势;重楼皂苷和顺铂均能抑制B16黑色素瘤细胞的生长，与空白对照组比较差异有显著性(F=39.12，P=0.000);重楼皂苷组与顺铂组间黑色素瘤细胞生长情况比较无显著性差异(P=0.966)。B16细胞兔眼角膜层间接种当天、第7天及角膜层间注射生理盐水、顺铂和重楼皂苷第28天时B16细胞实际生长情况，见图4。

图1 兔眼角膜层间B16细胞生长情况(空白对照组)

图2 兔眼角膜层间B16细胞生长情况(顺铂对照组)

图3 兔眼角膜层间B16细胞生长情况(重楼皂苷组)

图4 兔眼角膜层间B16细胞生长情况

3 讨论

中药重楼是延龄草科重楼属的总称，中国药典2000版、2005版收载为滇重楼和七叶一枝花的干燥根茎，民间使用的重楼品种较多，侧重不同。现代药理表明其具有抗肿瘤、止血、免疫调节及心血管方面等活性，重楼主要活性成分为甾体皂苷，由于苷元不同、糖配基种类及链接方式不同，所以其活性也表现出差异性［6］。多个体外细胞毒性实验研究表明重楼皂苷具有较好的抗肿瘤活性。颜璐璐等［7］以小鼠肺腺癌细胞株LA795为研究模型，研究滇重楼皂苷的抗肺癌活性，认为重楼总皂苷成分在体外、体内皆有强的抗肺癌作用。朱丽丽等［8］认为重楼皂苷可通过增加细胞内钙离子浓度诱导细胞凋亡，从而发挥抗胃癌SGC-7910细胞株增殖的作用。毕葳等［9］应用鸡胚绒毛尿囊膜模型研究重楼皂苷抑制血管生长的活性，研究表明重楼可能是1种有效的血管生成抑制剂。陈志红等［10］研究表明重楼总皂苷对人肺癌细胞A549有较高敏感性，毒性小，制备工艺简单。顺铂是临床上广泛使用的一线广谱化疗药物，对多种实体肿瘤有较好疗效。

B16鼠恶性黑色素瘤细胞，可以产生黑色素，作为细胞存活、生长和增生的可视指标;尤其在角膜透明的背景下，通过裂隙灯照相，利用图像分析软件，可以将细胞数量半定量化，所以利用B16角膜接种模型的优势可以筛选、评估抗肿瘤药物的疗效。本研究结果显示与生理盐水空白对照比较，重楼皂苷和顺铂均能抑制兔眼角膜层间B16黑色素瘤细胞的生长，差异有显著性;重楼皂苷组与顺铂组间黑色素瘤细胞生长情况比较无显著性差异。研究显示重楼皂苷在B16细胞兔眼角膜动物模型上显示具有较好的抗肿瘤活性。

本研究应用兔眼角膜B16黑色素瘤细胞动物模型，显示了重楼皂苷具有的抑瘤活性。重楼皂苷是重楼抗肿瘤作用的主要成分，相对重楼皂苷单体化合物而言，重楼总皂苷具有提取工艺相对简单和多组分、多靶点、多效应的药效优势;相对重楼醇提物等简单提取方法得到的中药粗提物而言，重楼总皂苷具有提高药物疗效，降低副作用等优势。重楼皂苷有望成为新的安全有效的抗肿瘤药，有较好的开发利用前景。

［1］赵保胜，朱寅荻，马 勇，等.中医重楼研究进展〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011，17(11):267.

［2］王艳霞.重楼抗肿瘤活性成分的体外实验研究〔J〕.包头医学，2008，32(4):196.

［3］王 羽，张彦军，高文远，等.滇重楼的抗肿瘤活性成分研究〔J〕.中国中药杂志，2007，32(14):1435.

［4］陈 剑，张鼎儒，李鸿波，等.诱导化疗加放疗同步化疗非小细胞肺癌的疗效观察〔J〕.实用癌症杂志，2012，27(2):187.

［5］金永东，梅 开，陈 萍，等.多西他赛联合顺铂治疗晚期头颈部肿瘤的疗效观察〔J〕.肿瘤基础与临床，2013，26(3):243.

［6］张 嫚，李彦文，李志勇，等.重楼属药用植物的研究进展〔J〕.环球中医药，2011，4(2):145.

［7］颜璐璐，张艳军，高文远，等.滇重楼皂苷成分体内外抗肺癌活性研究〔J〕.中草药，2009，40(3):424.

［8］朱丽丽，李惠芬.重楼皂苷对SGC-7910细胞增殖抑制及诱导凋亡的实验研究〔J〕.时珍国医国药，2009，20(6):1501.

［9］毕 葳，沈 葹，王鹏龙，等.重楼中几个甾体皂苷类成分对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响〔J〕.中成药，2012，34(8):1536.

［10］陈志红，龚先玲，刘 义，等.重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响〔J〕.实用医学杂志，2010，26(15):2687.