MicroRNA-10b对人肺腺癌细胞株A549增殖及侵袭能力的影响

刘 翼 李明慧 郭文佳 张国庆 庞作良

microRNA广泛存在于真核生物中，与肿瘤的关系极为密切［1-3］。miR-10b作为miRNA家族中的成员之一，目前认为其在多种实体肿瘤的侵袭转移过程中起着重要作用［4-5］。最近的研究表明，与良性肿瘤患者相比，肺癌患者中miRNA-10b的水平明显升高，而且，他们发现血清中miRNA-10b的高表达和淋巴结转移有关［6］。本研究通过转染表达miRNA-10b质粒进入人肺腺癌细胞株A549，观察miRNA-10b对人肺癌增殖及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验所需细胞系和主要试剂

人肺腺癌细胞株A549购于CCTCC(China Center for Type Culture Collection，中国典型培养物保藏中心);胎牛血清购自Gibco公司;RPMI-1640培养基购自Hyclone公司，miRNA-10b真核表达质粒由纽恩(上海)生物科技有限公司提供;脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;SYBRGreen PCR试剂盒购自Thermo公司;CCK-8购自日本同仁化学研究所;Transwell小室购于康宁公司。A549在含有10%胎牛血清的1640培养液中，37℃，5%CO2的条件下培养。

1.2 方法

取对数生长期的细胞接种于6孔板，设置成3个组，分别是:空白对照组，即未转染组;阴性对照组，即空载体转染组(NC序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT);miRNA-10b质粒转染组。细胞转染采用脂质体 lipofectamineTM 2000(Invitrogen)转染 siRNA，具体操作步骤:在转染前一天接种细胞，培养过夜，将5 μl lipofectamineTM2000加入250 μl改良型必需基本培养基(opti-MEM)中，在室温静置5 min;5 μl的siRNA加入250 μl opti-MEM中;将二者混合，室温放置20 min;吸去原有的细胞培养液，更换成无血清、无抗生素的培养液，再加入siRNA和500 μl脂质体转染混合液混匀;在37℃，5%CO2条件下培养4～6 h后换成正常培养液。转染后24 h使用荧光显微镜进行观察，确定转染效率。

1.2.1 检测各组细胞中miRNA-10b的表达 转染后48 h收集各组细胞，提取细胞总RNA，RNA样品用逆转录反应合成cDNA，使用实时定量PCR法检测样本中miRNA-10b的相对表达量。特异性引物序列:miRNA-10b 上游引物:5＇GGATACCCTGTAGAACCGAA-3＇，下游引物:5＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇;内参 U6 上游引物:5＇-TGGGGTTATACATTGTGAGAGGA-3＇，下游引物:5 ＇-GTGTGCTACGGAGTTCAGAGGTT-3 ＇。 根 据 公 式R=2-△△Ct，计算目的基因相对含量。

1.2.2 细胞增殖实验检测细胞增殖情况 将每块板设置空白对照组、阴性对照组和miRNA-10b质粒转染组，用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞株，稀释细胞［(1～5) ×104个细胞/ml培养液］，取 100 μl至96孔培养板，每组分为24、48和72 h 3个时间点，按1∶10体积比混合无血清必需基本培养基DMEM和Cell Counting Kit-8(CCK-8)，采用微板分光光度计测定450 nm波长吸光度。记录数值，并制作细胞生长曲线。

1.2.3 Transwell侵袭实验 实验前24 h将不同分组的细胞换成无血清DMEM培养基，接种前将transwell小室和24孔板用1×PBS浸泡5 min，用无血清DMEM培养液洗涤细胞，接种到transwell小室内，0.5 ml细胞悬液加入每个小室，0.75 ml含10%FBS的DMEM培养液加入下层的24孔板中，每组3复孔，于37℃培养箱中培养48 h，固定，染色，transwell小室内没有迁移的细胞用棉签擦去，显微镜下观察，计数每个视野中的细胞数。

1.3 统计学处理

实验结果为3次重复试验的平均值，采用SPSS 17.0统计学软件进行t检验，组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率

转染24 h后，荧光显微镜下观察，空白对照组未见绿色荧光，阴性对照组及miRNA-10b质粒转染组细胞中可见绿色荧光，转染效率高达70%。

2.2 转染后各组细胞miRNA-10b的表达

转染48 h后，通过实时定量PCR检测3组细胞中miRNA-10b的RQ平均值，结果显示，miRNA-10b质粒转染组中 miRNA-10b表达明显上调(RQ=1.34±0.13)，差异有统计学意义(P＜0.05);而阴性对照组(RQ=0.96 ±0.07)与空白对照组(RQ=0.99 ±0.08)比较，miRNA-10b表达水平无明显差异(P＞0.05)，见图1。

图1 转染后各组细胞miRNA-10b表达水平的变化

2.3 转染后各组细胞的增殖情况

miRNA-10b质粒转染组细胞生长速度高于空白对照组和阴性对照组细胞(P＜0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比无明显差异 (P＞0.05，图2)。

图2 miRNA-10b对人肺腺癌细胞株A549增殖的影响

2.4 Transwell结果

miRNA-10b质粒转染组明显较空白对照组、阴性对照组有更多的细胞迁移到Transwell膜的另一侧(P＜0.05)，而空白对照组与阴性对照组无明显差异(P＞0.05)，说明转染miRNA-10b真核表达质粒的A549细胞侵袭能力增强。

3 讨论

多种因素，如各种调控基因及细胞因子等，形成了复杂的网络结构，影响肿瘤细胞的生长调控。环境影响基因突变、可遗传的表观遗传学改变等都能够影响细胞的生物学性状。microRNA作为调控性的小分子RNA，在肿瘤中的作用越来越受到重视。最近的研究表明，microRNA自身的调控，尤其是表观遗传学层次的调控，不但影响肿瘤细胞的生物学特性，还对肿瘤的分期预后也具有相当的影响及提示作用［7-8］。

miR-10b定位于HOX基因簇，它的功能不仅仅是维持正常组织的增殖分化，还在肿瘤的发生及侵袭过程中发挥重要作用，有研究表明miR-10b促进多种恶性肿瘤细胞的侵袭及转移［9-11］。我们的研究通过体外实验，将表达miRNA-10b的质粒转染入A549细胞中，获得过表达miRNA-10b的A549细胞，根据细胞增殖实验结果可以看出，miRNA-10b表达量增高的细胞增殖速度加快;我们通过transwell检测了A549细胞侵袭能力的改变，结果提示:过表达MiRNA-10b可以增强A549细胞侵袭能力。

有研究表明，在肺癌发生发展过程中，多种miRNA都可作为抑癌基因或癌基因起调控作用。我们可以通过导入外源的有抑癌基因功能miRNA，或者采用多种方法下调或抑制有抑癌基因功能的miRNA的表达，起到诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的作用［12］。我们通过研究认为:miRNA-10b可以促进人肺腺癌细胞的增殖及侵袭。我们有理由相信，随着研究的进一步深入，miRNA-10b靶基因及调控机制得以确定，miRNA-10b有可能成为肺癌治疗的1个新的靶点。

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