CD147－shRNA重组质粒对裸鼠肝癌细胞SMMC－7721皮下移植瘤的抑制作用

田 广，刘晶晶，房学东，宫路路＊

（1.梅河口市中心医院，吉林 梅河口 135000；2.吉林大学第二医院 普通外科，吉林 长春 130041）

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，恶性度高，常规治疗方法较难取得良好的预后，针对肿瘤细胞的靶向治疗研究更显突出。CD147是一种与肝癌密切相关的单次跨膜糖蛋白，参与肿瘤细胞的浸润转移。本实验通过将本室前期构建的CD147－sh RNA转染至肝癌细胞SMMC－7721，接种到裸鼠皮下组织内观察肿瘤的生长情况，进一步证实CD147－sh RNA重组质粒在体内的抑瘤作用。

1 材料和方法

1.1 细胞和质粒 p BS／U6由斯坦福大学孙自捷教授惠赠；pBS／U6／CD147－sh RNA3本室构建并保存［1］；肝癌细胞SMMC－7721由东北师范大学遗传所 提 供；SMMC－7721／pBS／U6 及 SMMC－7721／p BS／U6／CD147－shRNA3分别为转染空质粒和转染重组质粒pBS／U6／CD147－sh RNA3的细胞株，由本室转染成功并保存；

1.2 试验动物 BALB／c－nu／nu小鼠24只，雄性，5周龄，体重15－20 g，购自中国科学院上海实验动物中心，由东北师范大学细胞和遗传所饲养。

1.3 动物饲养 裸鼠饲养在无特定病原 （specificpathogen free，SPF）层流柜中，调节室温为26－28℃，相对温度保持在40%－60%，定期通风，每日维持10小时光照，14小时无光的明暗周期；室内定期进行紫外灯照射，笼具、垫料、饮水、饲料均高压蒸汽消毒，每周清洁笼具和垫料，饮水、饲料均经灭菌处理，饮水中加入复合维生素（例如，每1 000 ml加入1 ml各种维生素）。

1.4 动物分组 将24只裸鼠按数字表法随机分成3组，每组8只；其中A组接种SMMC－7721细胞；B组 接 种 SMMC－7721／pBS／U6－control；C 组 接 种SMMC－7721／p BS／U6／CD147－sh RNA3。

1.5 裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型建立 取对数生长期（50%－70%面积）的三种细胞，用0.25%胰酶消化，PBS洗两次，1 000 rpm离心5 min，收集细胞；用0.9%的生理盐水悬浮细胞，定容；以5×106／0.2 ml分别接种于裸鼠前腿腋下皮下组织内，用微量注射器注入，形成直径3 mm左右的皮下隆起。

1.6 裸鼠成瘤情况观察 种植完成后每日观察接种肿瘤生长情况，观察注射部位有无感染及肿瘤自然消退；成瘤后每5 d用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）及短径（b），取各组长短径平均值，计算肿瘤体积。计算公式为体积（V）＝a×b2／2。40 d时处死裸鼠，取出瘤块进行称重，大体观察移植瘤的形态并拍照，计算抑瘤率：公式为（对照组种植瘤质量－CD147－sh RNA转染组种植瘤质量）／对照组种植瘤质量×100%。

1.7 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

平均8－10 d裸鼠腋窝皮下接种处出现瘤块，直径2－4 mm，成瘤率100%，随着饲养时间的延长，瘤块逐渐增大，无自发消退现象。饲养30－35 d时A组和B组分别有两只裸鼠死于肿瘤恶液质。

根据每周观察裸鼠肿瘤生长情况绘制肿瘤体积生长曲线，如图1所示，A组和B组生长速度大至相同，两组间无明显差异；而C组生长速度明显慢于A组及B组。从20 d开始C组瘤块平均体积生长明显慢于A、B组，体积差别有统计学差异。见表1。

图1 裸鼠肿瘤体积生长曲线

表1 三组裸鼠种植瘤块平均体积（±s）组别 n瘤块平均体积（mm3）5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d 35 d 40 d A 6 0 31.6±7.6 62.1±28.6 153.3±76.7 205.9±132.0 258.1±100.3 402.8±104.1 559.5±120.2 B 6 0 32.9±12.8 47.8±19.1 143.1±58.1 175.0±73.7 253.5±111.2 358.4±95.5 523.1±153.6 C 8 0 27.6±5.8 37.3±6.5 60.4±15.7＊ 83.5±26.6＊ 109.8±35.7＊ 160.6±76.3＊ 193.5±73.7＊注：与A组及B组相比，＊P＜0.05

饲养40 d时统一处死裸鼠，取出皮下瘤块，大体观察肿瘤呈粉红色，表面凹凸不平，呈结节状，切面为灰白色；将瘤块进行称重，A组和B组间无明显差异，C组裸鼠之瘤块重量明显小于A组和B组，有统计 学 差 异；与 A 相 比，SMMC－7721／p BS／U6－CD147－sh RNA3细胞在裸鼠体内所成肿瘤生长明显减缓，抑瘤率为64.8%。见表2。

表2 三组裸鼠种植肿瘤瘤块40 d时平均重量（±s）及抑瘤率

表2 三组裸鼠种植肿瘤瘤块40 d时平均重量（±s）及抑瘤率

注：与A组及B组相比，＊P＜0.05

组别 n 肿瘤重量（mg） 抑瘤率（%）A 6 2327.3±812.4 B 6 2203.3±552.9 C 8 819.2±289.9＊64.8

3 讨论

裸鼠皮下移植瘤模型是常用的一种肿瘤实验研究模型，具有方法简便，成瘤率高，易于观察、测量等优点，因而在肿瘤研究中得了广泛应用。本试验中我们将肝癌细胞系SMMC－7721及转染空质粒的SMMC－7721／PBS／U6和转染重组质粒的 SMMC－7721／pBS／U6／CD147－sh RNA3三种细胞接种于裸鼠皮下以观察肿瘤生长情况。

裸小鼠（nude mice）由于无胸腺而仅有胸腺残迹或异常胸腺上皮，导致缺乏成熟的T淋巴细胞，因而细胞免疫功能低下，BALB／c－nu是目前常用裸小鼠品系，裸鼠用作肿瘤种植实验，方法简单，无需对动物作特殊前处理，而且异种肿瘤种植成功率相当高。本试验中接种的肿瘤细胞全部成瘤，种植传代后的肿瘤组织仍保留其原有的生物学特性，种植瘤可以一直在裸鼠体内或体表生长。裸鼠皮下接种后形成的瘤体不与皮肤及皮下组织粘连，极易分离便于观察、测量和活体检查，一般选择腋下接种，此部分血供丰富，有利于肿瘤生长；瘤块成长后方便取出进行测量。本试验是采用腋窝皮下接种。

我们将肿瘤细胞按5×106／0.2 ml分别接种于裸鼠前腿腋下皮下组织内，每天观察裸鼠生长情况，约8－10 d后所有裸鼠均有肿瘤生长，直径约3－4 mm，成瘤率100%，每5 d测量一次肿瘤组织大小。接种后30 d左右时A组和B组各有两只裸鼠死于肿瘤恶液质状态。40 d时处死全部裸鼠并切取肿瘤观察肿瘤生长情况，转染CD147－sh RNA3后的SMMC－7721细胞肿瘤生长较慢，且CD147表达明显减弱，提示通过RNAi干扰肝癌细胞SMMC－7721的CD147表达后，可以抑制肿瘤生长，抑瘤率可达68.4%。证实CD147在肝癌的发展过程中起了很大作用，而通过RNAi技术抑制肝癌细胞中CD147的表达对抑制肿瘤的生长和浸润转移取得良好的效果。由于CD147在正常组织几乎不表达，而在肿瘤组织中表达明显增高，我们构建的CD147－sh RNA3具有靶向性、特异性，而对正常组织几乎无不良影响。转染重组质粒组裸鼠肿瘤较对照组有统计学差异，但肿瘤仍呈渐进性生长，也印证了不可能通过抑制单一基因的表达而治愈肿瘤。但该模型的不足之处是不能模拟HCC中复发转移等生物学特征。

本试验中选择了CD147做为靶基因进行干预，取得了较好的效果。但肝癌的发生发展是多基因多步骤的复杂过程，一些相关研究表明，应用RNAi技术抑制另外一些与肝癌关系密切相关的基因，如survivin［2］、h TERT［3］、MDR［4］等，也为肝癌的基因治疗提供了靶点。我们的试验则提供了另一个重要的干预靶点。

［1］宫路路，林瑞新，李晓萌，等.CD147－shRNA对肝癌细胞CD147表达的抑制作用［J］.中国普通外科杂志，2010，19（1）：41.

［2］Cheng SQ，Wang Wl，Yan W，et al.Knockdown of survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in hunan hepatocellular carcinoma cell line SMMC－7721［J］.World J Gastroenterol，2005，11（5）：756.

［3］Zhang PH，Zou L，Tu ZG.RNAi－h TERT inhibition hepatocellular carcinoma cell proliferation via decreasing telomerase activity［J］.J Surg Res，2006，131（1）：143.

［4］Chen XP，Wang Q，Guan J，et al.Reversing multidrug resistance by RNA interference through the suppression of MDR1 gene in human hepatoma cells［J］.World J Gastroenterol，2006，12（21）：3332.