有效检测发酵豆粕中抗原蛋白的新方法

■王 寅 王希辉 张克顺

（1.山东省计量科学研究院，山东济南 250014；2.青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛 266700）

发酵豆粕作为优质的植物蛋白原料，因具有合理的氨基酸组成，适口性好，养分利用率高而被广泛地应用在畜牧养殖中。但其存在较多的抗营养因子，如抗原蛋白、胰蛋白酶抑制剂、脲酶等。而抗原蛋白的危害最为严重，它会引起仔猪发生过敏性腹泻，肠黏膜细胞增生等一系列不良反应，甚至造成死亡[1]。因此抗原蛋白含量高低成为评判发酵豆粕品质的一项重要指标。

目前测定抗原蛋白的方法主要有SDSPAGE、高效液相色谱法和ELISA法[2]。但由于加工工艺不同，高温会使发酵豆粕表层蛋白变性，发生美拉德反应[3]，使用Tris-HCl等常规提取液[4]不能将被变性蛋白包裹的抗原蛋白提取出来，因此使用SDS-PAGE、高效液相色谱、ELISA等检测获得抗原蛋白量并不能说明发酵豆粕中抗原蛋白的真实水平。我们通过多次试验对比和探索，最终选择用0.6%的KOH[5]处理发酵豆粕样品，可有效提取可溶性蛋白，且提取量大致相当，将提取的上清液进行SDS-PAGE电泳，并用Gelanalyzer软件对电泳图进行蛋白质条带分析，得出抗原蛋白占总可溶性蛋白百分含量，依此来判断发酵豆粕中抗原蛋白的降解程度。

1 材料与方法

1.1 材料

豆粕：样品1（烘干进风温度300℃）、样品2（烘干进风温度240℃）、样品3（烘干进风温度140℃）均为国内某公司发酵豆粕产品，未发酵生豆粕。

仪器：磁力搅拌器，粉碎机，分光光度计，酶标仪，蛋白质电泳仪，分析天平，样品筛。

试剂：pH值8.0的0.03 M Tris-HCl（含0.03 M β-巯基乙醇），0.2%、0.4%、0.6%的氢氧化钾溶液，SDS-PAGE电泳所用试剂，抗原蛋白定量测定试剂盒（ELISA法），Bradford法所用试剂。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

取需要检测的发酵豆粕样品，用四分法缩减分取200 g左右，粉碎过0.25 mm孔径的样品筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用[5]。

1.2.2 试验步骤

1.2.2.1 样品Tris-HCl处理后SDS-PAGE电泳

为检验Tris-HCl对发酵豆粕样品中抗原蛋白的提取效率，试验取样品1.000 0 g加入50 ml 0.03 M Tris-HCl样品处理液，放在磁力搅拌器（200 r/min）上搅拌 60 min，以 2 700 r/min离心10 min。取上清液100 μl，加100 μl 2×上样缓冲液，摇匀，沸水浴5～10 min，处理液进行SDS-PAGE电泳。

1.2.2.2 抗原蛋白定量测定试剂盒（ELISA法）测抗原蛋白

为验证ELISA法对发酵豆粕样品中抗原蛋白的检测效果，试验选择国产抗原蛋白定量试剂盒对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白进行定量检测，方法按试剂盒说明书。

1.2.2.3 样品氢氧化钾溶液处理后SDS-PAGE电泳

为有效提取出可溶性蛋白，试验选择提取率较好的氢氧化钾，提取液进行蛋白质电泳分析，方法为：称取大豆粕试样1.0 g，精确到0.1 mg,置于250 ml高型烧杯中，加人0.2%、0.4%、0.6%氢氧化钾溶液50.00 ml，放在磁力搅拌器（200 r/min）上搅拌60 min。将溶液转移至离心管中，以2 700 r/min离心10 min，取上清液100 μl，加100 μl 2×上样缓冲液，摇匀，沸水浴5～10 min，处理液进行SDSPAGE电泳。同时用Bradford法[6]测定处理上清液中可溶性蛋白含量，以确定能溶解可溶性蛋白量大致相近的合适氢氧化钾溶液浓度。将确定的氢氧化钾溶液浓度的处理样品上清液进行SDS-PAGE电泳。

1.2.2.4 Gelanalyzer软件对蛋白质凝胶图片进行抗原蛋白分析

取以上已确定的氢氧化钾溶液浓度的处理样品上清液所获得的SDS-PAGE电泳图，使用Gelanalyzer软件选择某一泳道的全部区域，计算整个区域的光密度值，然后根据光强度选择α'、α、β、acid、base亚基蛋白条带，计算出各亚基的光密度值，并计算各亚基抗原蛋白所占总可溶性蛋白的百分比。抗原蛋白占总可溶性蛋白的比例越低，说明发酵豆粕中抗原蛋白被降解得越好。

2 结果

2.1 样品Tris-HCl处理后SDS-PAGE电泳

用0.03 M Tris-HCl样品处理液处理发酵豆粕，离心获得的上清液进行SDS-PAGE电泳，加样量为10 μl。由电泳图可知（图1），样品3抗原蛋白条带较明显，样品2次之，样品1抗原蛋白条带最淡最少。实际上用Tris-HCl样品处理液处理的上清中抗原蛋白含量差异较大，对如干燥程度适合的样品3的溶解效率较好，但不能将干燥过度的发酵豆粕样品1、2中的可溶性蛋白提取出来，所以根据SDS-PAGE电泳图并不能说明抗原蛋白条带少和浅的样品中实际抗原蛋白量就少。

图1 不同样品常规处理后SDS-PAGE电泳

2.2 抗原蛋白定量测定试剂盒（ELISA法）测抗原蛋白

按试剂盒说明书对4种豆粕样品进行抗原蛋白含量的检测。其样品处理液主要为Tris-HCl、β-巯基乙醇等，所得结果如表1所示。

表1 ELISA法定量检测样品中的抗原蛋白

由表1可知，使用试剂盒中的样品提取液提取，样品1中的抗原蛋白仍很低，而样品2和样品3分别是其4倍和27倍左右。由于样品提取液的提取效率因素，ELISA法定量测定的只是溶解到提取液中抗原蛋白的量，由于发酵豆粕表层蛋白变性和发生美拉德反应使抗原蛋白不能很好地释放出来，所以ELISA法也不能检测样品中抗原蛋白的实际含量。

2.3 样品氢氧化钾溶液处理后SDS-PAGE电泳

试验用0.2%、0.4%、0.6%氢氧化钾溶液分别处理各发酵豆粕样品，同时用Bradford法[6]测定可溶性蛋白含量。确定能溶解可溶性蛋白量大致相近的合适氢氧化钾溶液浓度。最终确定0.6%氢氧化钾溶液处理样品60 min所获得的可溶性蛋白的量大致相当，如表2。

表2 Bradford法测定发酵豆粕样品中可溶性蛋白含量

将0.6%氢氧化钾溶液处理样品上清液进行SDS-PAGE电泳，所得电泳图见图2。

图2 不同样品0.6%氢氧化钾处理后SDS-PAGE电泳

从图2可以看出，样品1、2经0.6%氢氧化钾溶液处理后进行SDS-PAGE电泳，出现明显的抗原蛋白条带，且比样品3的抗原蛋白条带更深，说明0.6%氢氧化钾溶液可将样品1、2中被蛋白质变性表层包裹的抗原蛋白提取出来，同时说明样品1、2比样品3干燥程度高。

根据图2，使用Gelanalyzer软件对电泳图进行蛋白条带分析，选择并计算整个泳道的全部区域和抗原蛋白各亚基的光密度值（图3），计算出抗原蛋白各亚基所占总可溶性蛋白的百分比及得出抗原蛋白降解程度，如表3。

由表3可知，样品1、2、3与未发酵豆粕相比，各抗原蛋白亚基百分含量都有明显降低，而样品3比样品1、2降低的幅度大，说明样品3中抗原蛋白的降解程度高于样品1、2。这也正如SDS-PAGE电泳图所示，样品3的杂带较多，分解的蛋白使整个泳道表观更为弥散。也由此说明样品Tris-HCl处理后SDS-PAGE电泳图的表观结果及ELISA法定量测定的抗原蛋白值与实际不符。

图3 根据光强度选择抗原蛋白条带

表3 抗原蛋白各亚基所占总可溶性蛋白的百分比

3 讨论

SDS-PAGE和ELISA法是当前测定发酵豆粕中抗原蛋白简单易行的方法。而SDS-PAGE主要是用常规提取液Tris-HCl提取样品进行蛋白质电泳以观察豆粕抗原蛋白的降解情况。因发酵豆粕在干燥工序的烘干温度不相同，温度过高会发生蛋白质变性和美拉德反应，所以造成用Tris-HCl提取可溶性蛋白效率上存在很大差异，因而使用以上提取方法不能真正说明发酵豆粕中抗原蛋白的水平。试验也尝试使用高浓度的Tris-HCl提取可溶性蛋白，但对干燥程度高的发酵豆粕的提取量依然较低。使用ELISA法检测抗原蛋白，由于提取液（主要成分为Tris-HCl、β-巯基乙醇）也不能破坏豆粕变性的蛋白质表面，抗原蛋白不能有效释放，获得的数值仅为溶解到提取液中的抗原蛋白。如用一定浓度的KOH提取抗原蛋白然后用ELISA法检测其含量，因KOH会使蛋白质变性，抗体不能与抗原反应，因此也不能获得有效数值。

综合以上试验方法的缺点，通过试验确定用0.6%的氢氧化钾破坏发酵豆粕变性表面，并提取出足够量的可溶性蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳，使用Gelanalyzer软件对电泳图进行分析，通过计算抗原蛋白所占可溶性蛋白的比例，分析样品中的抗原蛋白的降解情况，因此获得的结果比较客观、准确。

本法因提取可溶性蛋白的效率较高，比用Tris-HCl提取更能真实说明发酵豆粕抗原蛋白水平。结合Gelanalyzer软件分析，获得可溶性蛋白中抗原蛋白的比例，从而较为客观说明发酵豆粕抗原蛋白的降解情况。使用方法可同时结合检测氢氧化钾蛋白质溶解度[5]及肽的含量[7]，了解发酵豆粕是否过熟及抗原蛋白的降解程度，以佐证发酵豆粕产品的品质。