刺参酸性黏多糖对人肝癌Hep G2细胞增殖的影响

金岩,宋扬,陈沉

(青岛大学医学院营养研究所,山东青岛 266021)

刺参酸性黏多糖对人肝癌Hep G2细胞增殖的影响

金岩,宋扬,陈沉

(青岛大学医学院营养研究所,山东青岛 266021)

目的了解刺参酸性黏多糖(SJAMP)对体外培养的人肝癌Hep G2细胞增殖的影响。方法体外培养HepG2细胞,MTT法检测SJAMP对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法检测细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达,以正常肝细胞(张氏细胞)作为对照。结果SJAMP能抑制Hep G2细胞增殖,且随着干预剂量(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)和干预时间(12、24、48 h)延长其抑制作用增强(F＝68.430～596.680,q＝3.714～55.029,P＜0.05);不同浓度SJAMP作用对张氏细胞增殖无明显的抑制作用(P＜0.05)。随着SJAMP剂量的增加,Hep G2细胞停留在G1期比例增加,S期、G2期的细胞减少(F＝4.483～18.791,q＝1.921～9.876,P＜0.05);对于张氏细胞,SJAMP作用后其细胞周期未发生显著改变(P＞0.05)。SJAMP作用后HepG2细胞的PCNA表达降低,且随着SJAMP作用剂量的增加而降低(F＝2 688.640,q＝55.365～156.296,P＜0.05);张氏细胞PCNA表达未发生显著变化(P＞0.05)。结论SJAMP通过诱导HepG2细胞发生细胞周期G1期阻滞并抑制其PCNA表达,从而抑制Hep G2细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。

多糖;刺参属(动物);肝肿瘤;细胞增殖

刺参酸性黏多糖(SJAMP)为海洋腔肠类动物体内富含的一类天然海洋活性物质。近来研究表明,SJAMP具有抗肿瘤活性,成为抗肿瘤药物研究的热点[1]。目前,国内外对SJAMP抗肿瘤作用的研究多集中在其对机体免疫系统作用方面[2-4],其对肿瘤的直接抑制作用研究较少。我们的前期研究结果显示,SJAMP对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝肿瘤具有抑制作用,能够降低其肿瘤发生率[5],但SJAMP直接作用于肝肿瘤细胞产生的作用及其机制尚待探讨。本研究以人肝癌细胞株Hep G2细胞为实验细胞株,人正常肝细胞(张氏细胞)株为对照,探讨SJAMP对细胞增殖的影响,为SJAMP抗肿瘤机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人肝癌细胞系Hep G2、人正常肝细胞张氏细胞系,购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂 SJAMP,购自中国海洋大学食品科学与工程学院;高糖DMEM培养液、1640培养液及胎牛血清,均为美国Hyclone公司产品;四甲基偶氮唑盐(MTT),Sigma公司产品;细胞周期与凋亡检测试剂盒,碧云天生物技术研究所产品;兔抗人增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白抗体、SP-0023试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.1.3 仪器与设备 恒温CO2培养箱;Olympus显微镜;酶标仪;流式细胞仪;超净工作台等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HepG2细胞常规培养于含体积分数0.10胎牛血清的高糖DMEM培养液,张氏细胞培养于含体积分数0.10胎牛血清的1640培养液,置于于37℃、含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 MTT法检测SJAMP对细胞增殖的影响①常规培养Hep G2细胞和张氏细胞,取对数生长期的细胞,用2.5 g/L胰蛋白酶消化制成细胞悬液,密度为1×1010/L。②将制备好的细胞悬液接种到96孔板,每个剂量组设5个平行孔,每孔200μL。置37℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中孵育过夜,待细胞贴壁。③弃去各孔培养液,换含有不同浓度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培养液(内含体积分数0.10胎牛血清),分别培养12、24、48 h。④加入5 g/L的MTT溶液20μL,放入培养箱中继续培养4 h后,吸出各孔中的液体,每孔加入150μL的DMSO,快速振荡1 min,待结晶产物充分溶解后,酶标仪测490 nm波长处各孔吸光度(A)值,计算各组A值平均值及干预48 h时不同浓度SJAMP对Hep G2细胞抑制率。抑制率＝(未干预组A值－干预组A值)/未干预A值×100%。

1.2.3 碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞周期 ①取对数生长期细胞,2.5 g/L胰酶消化后制成细胞悬液,密度为1×107/L,接种于6孔板,每个剂量组设3个平行孔,置于37℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养24 h。②吸出每孔培养液,换含有不同浓度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培养液(内含体积分数0.10胎牛血清)继续培养24 h。③2.5 g/L胰酶消化各孔细胞,以1 000 r/min离心3 min,PBS清洗2次,体积分数0.70冰乙醇固定细胞4 h,冰浴PBS清洗细胞,以1 000 r/min离心3 min。④加PI染液,缓慢并充分重悬细胞,37℃避光温浴30 min后,流式细胞仪检测。

1.2.4 免疫细胞化学法检测PCNA的表达 ①处理细胞爬片:载玻片经酸、乙醇、多聚赖氨酸浸泡后,高压灭菌。②消化细胞,制备细胞悬液,密度为5× 107/L。将高压灭菌处理的载玻片置于细胞培养皿中,玻片中央滴两滴制备好的细胞悬液,培养皿置于37℃、体积分数0.05 CO2培养箱中,待细胞完全贴壁后,每个培养皿中加入含体积分数0.10胎牛血清的培养液。12 h后,弃去各培养皿中的培养液,换含不同浓度SJAMP(0、0.5、2.0、8.0 mg/L)的培养液(含体积分数0.10胎牛血清)。③24 h后,取出玻片,PBS冲洗3次,冰丙酮固定5 min。④向玻片上滴加体积分数0.01的Trition-X100溶液,10 min后,PBS冲洗3次。⑤滴加体积分数0.3的H2O2, 15 min后,PBS冲洗3次。⑥按照SP-0023试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色,DAB显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水,中性树胶封片。细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。光镜下随机选择5个以上高倍视野(600倍),每个视野计数100个细胞,计算阳性细胞指数(%)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度SJAMP作用不同时间对Hep G2细胞和张氏细胞增殖的影响

对于Hep G2细胞,在干预时间相同条件下,随着SJAMP干预浓度的升高,A值显著降低(F＝68.430～596.680,q＝3.714～55.029,P＜0.05);干预剂量相同时,24 h组A值与12 h组比较明显升高,48 h组与24 h组比较升高不明显。3个干预组作用48 h后的抑制率分别为11.13%、14.92%、18.63%。见表1。对于张氏细胞,相同时间、不同浓度SJAMP干预后,各组A值差异无显著性(F＝0.462～0.629,P＞0.05);同一干预浓度条件下,随着干预时间的延长,各组A值均明显升高,差异有显著性(F＝55.597～199.703,q＝6.357～29.275, P＜0.05)。见表2。

2.2 不同浓度SJAMP对细胞周期的影响

SJAMP干预使HepG2细胞的细胞周期发生变化,停留在G1期的细胞增多,S期和G2期的细胞减少,随着SJAMP干预浓度的增加而变化,各组比较差异有显著性(F＝4.403～18.791,q＝1.921～9.876,P＜0.05)。见表3。对于张氏细胞,不同浓度SJAMP作用后,细胞处于G1、S、G2期的比例未发生显著改变(P＞0.05)。见表4。

2.3 不同浓度SJAMP对PCNA表达的影响

不论是否有SJAMP干预,Hep G2细胞和张氏细胞中均有PCNA的表达。对于Hep G2细胞,随着SJAMP浓度增加,PCNA表达降低,各组比较差异有显著性(F＝2 688.640,q＝55.365～156.296, P＜0.05)。对于张氏细胞,不同浓度SJAMP干预后,其PCNA表达未出现明显的变化(P＞0.05)。见表5。

表1 不同浓度SJAMP干预不同时间对HepG2细胞A值的影响(n＝5，±s)

SJAMP浓度_(ρ/mg·L－1)______ _______________________________________________作用时间(t/h) 12____________________________________ _24________ 48 0 1．631±0．015 1．777±0．026 1．807±0．018 0．5 1．580±0．013 1．615±0．012 1．606±0．007 2．0 1．507±0．008 1．526±0．016 1．537±0．005 ______8．0_______1．424±0．083__1．452±0_____________________．015 1．470±0．017

表2 不同浓度SJAMP干预不同时间对张氏细胞A值的影响(n＝5,±s)

SJAMP浓度_(ρ/mg·L－1)______ _______________________________________________作用时间(t/h) 12____________________________________ _24________ 48 0 1.682±0.044 1.779±0.045 1.868±0.007 0.5 1.676±0.018 1.778±0.031 1.867±0.008 2.0 1.670±0.033 1.793±0.017 1.872±0.007 ______8.0_______1.666±0.025__1.799±0_____________________.010 1.873±0.010

表3 不同浓度SJAMP对HepG2细胞周期的影响(n＝3,χ/%,±s)

SJAMP浓度(ρ/mg·L－1)G1期S期G2期0 53.121±1.470 28.491±0.430 18.388±1.248 0.5 55.980±1.086 26.381±0.365 17.639±0.774 2.0 59.047±0.887 23.572±1.130 17.381±0.524 _____8.0______67.816±4.660_22.572±1.815________________ 12.945±3.741

表4 不同浓度SJAMP对张氏细胞周期的影响(n＝3, χ/%,±s)___________________________________________

SJAMP浓度(ρ/mg·L－1)G1期S期G2期0 59.278±2.174 26.508±2.040 14.214±1.341 0.5 59.654±0.424 25.763±0.765 14.583±1.187 2.0 56.930±0.522 26.091±1.271 16.313±1.645 _____8.0______57.877±1.541_25.073±1.591________________ 17.023±0.620

表5 不同浓度SJAMP干预后Hep G2细胞和张氏细胞PCNA的表达(n＝3,±s)_____________________________

SJAMP浓度(ρ/mg·L－1)___Hep G2细胞_____________________ _张氏细胞0 0.591±0.006 0.585±0.003 0.5 0.496±0.005 0.578±0.005 2.0 0.385±0.003 0.584±0.007 ___________8.0________________________________________________ 0.272±0.004 0.581±0.005

3 讨 论

近年来,随着人们对多糖研究的不断深入,多糖对肿瘤的抑制作用越来越受到重视。已有研究结果显示,云芝多糖能够抑制结肠癌细胞的增殖[6]。我们前期研究结果已证实,SJAMP能够抑制Hela细胞增殖[7],对DEN诱导的大鼠肝肿瘤也具有抑制作用[5]。本研究结果显示,SJAMP作用于Hep G2细胞后对其增殖具有抑制作用,而且在一定范围内随着剂量增大和作用时间延长,其抑制作用明显增强;SJAMP不影响正常肝细胞的增殖。

真核细胞的细胞周期分为间期和分裂期(M期),间期包括G1期、S期和G2期,细胞周期大部分时间处于间期,染色体复制发生在S期(DNA合成期),G2期之后进入M期。G1期是惟一能接受外界信息刺激的时期,位于该时期的限制点是G1期～S期转换的关键时点,该点的转换决定了细胞继续增殖还是停滞或死亡[8]。有研究表明,螺旋藻多糖可抑制Hela细胞和Hep G2细胞的增殖,使细胞发生G1期阻滞[9]。我们前期研究结果也显示, SJAMP可使Hela细胞发生G1期阻滞[1,8]。本研究结果显示,SJAMP能够使Hep G2细胞发生G1期阻滞,相同干预条件下,张氏细胞的细胞周期未发生显著改变。表明SJAMP通过阻滞细胞周期,促使HepG2细胞停滞在G1期,抑制Hep G2细胞的增殖,发挥抗肿瘤的作用。

PCNA是DNA多聚酶δ的辅助蛋白,是真核细胞DNA合成过程所必需的一种核蛋白,其作用是调节DNA多聚酶的活性。已有研究表明,PCNA含量随细胞周期的不同而变化,G1期开始增加,至S期达到高峰,G2、M期又明显下降,G0期维持在最低水平,其变化过程与DNA的合成过程一致。目前,PCNA的表达被用来作为评价细胞增殖状态、反映细胞增殖动力学的指标[2,8]。我们的前期研究显示,SJAMP能够降低Hela细胞PCNA的表达[1,8]。本文结果表明,SJAMP干预后,Hep G2细胞中PCNA的表达随着干预剂量的增加而降低,而张氏细胞PCNA的表达则无显著改变。本实验中Hep G2细胞PCNA表达的变化与细胞周期的变化是一致的,表明SJAMP通过影响细胞周期而抑制Hep G2细胞的增殖。SJAMP抗肿瘤机制可能与SJAMP影响Hep G2细胞DNA合成有关。

综上所述,SJAMP对Hep G2细胞增殖具有明显的抑制作用,使细胞发生G1期阻滞,对正常肝细胞的增殖无抑制作用,表明SJAMP具有一定的抗肝癌作用。本文结果为SJAMP在肝癌防治中的应用提供了初步的实验依据,其确切的机制还有待于进一步深入研究。

[1]牛娟娟,宋扬.海洋刺参多糖对宫颈癌细胞周期的影响及机制[J].齐鲁医学杂志,2010,25(5):386-388.

[2]牛娟娟,宋扬.刺参黏多糖的生物活性物质作用研究进展[J].华北煤炭医学院学报,2009,11(5):651-652.

[3]宋迪,吉爱国,梁浩,等.刺参生物活性物质的研究进展[J].中国生化药物杂志,2006,27(5):316-319.

[4]苏秀榕,娄永江,常亚青,等.海参的营养成分及海参多糖的抗肿瘤活性的研究[J].营养学报,2003,25(2):181-182.

[5]梁囡囡,宋扬,金守杰.刺参酸性黏多糖对DEN诱导肝癌形成抑制作用[J].齐鲁医学杂志,2012,27(4):316-318.

[6]周永.多糖类抗肿瘤作用的研究进展[J].国外医学:卫生学分册,2001,28(3):129-132.

[7]王颖,于壮,宋扬.刺参酸性黏多糖对人宫颈癌Hela细胞caspase表达影响[J].齐鲁医学杂志,2008,23(3):191-194.

[8]张笑雪,于壮,宋扬.刺参黏多糖对Hela细胞PCNA表达及细胞周期的影响[J].山东医药,2008,48(46):19-21.

[9]于红,张学成.螺旋藻多糖抗肿瘤作用的实验研究[J].高技术通讯,2003,13(7):83-86.

(本文编辑 黄建乡)

EFFECT OF STICHOPUS JAPONICUS ACID MUCOPOLYSACCHARIDE ON PROLIFERATION OF LIVER CANCER CELL HepG2

JIN Yan,SONG Yang,CHEN Chen (Department of Nutrition,Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

Objective To study the effect of stichopus japonicus acid mucopolysaccharide(SJAMP)on proliferation of human liver cancer cell HepG2.MethodsHepG2 cells were cultured in vitro.MTT assay was used to observe the effect of SJAMP on proliferation of HepG2 cells.The cell cycle was measured using flow cytometry(FCM).The expression of PCNA was tested by immunocytochemistry.Normal liver cells(Zhang’s liver cells)were served as the control.ResultsSJAMP could inhibit the proliferation of HepG2 cells,its depressant effect reinforced along with the increase of intervention dose(0,0.5,2.0, 8.0 mg/L)and extension of intervention time(12,24,48 h)(F＝68.430－596.680;q＝3.714－55.029;P＜0.05);Different concentrations of SJAMP did not show apparent inhibition on proliferation of Zhang’s cells(P＜0.05).The results of cell cycle detection indicated that with the increase of SJAMP dose,the Hep G2 cells that trapped in G1 phase increased(F＝4.483－18.791;q＝1.921－9.876;P＜0.05);as for Zhang’s cells,no changes of cell cycle were noted after interfered with SJAMP(P＞0.05)Immunocytochemical technique indicated that after SJAMPintervention,the expression of PCNA in Hep G2 cells declined,the expression decreased as the dose of SJAMP increased(F＝2 688.640,q＝55.365－156.296,P＜0.05),no notable effect on the expression of Zhang’s cells was observed(P＞0.05).ConclusionSJAMP plays an anti-tumor action through inhibiting the proliferation,blocking cell cycle and decreasing expression of PCNA of Hep G2 cells.

polysaccharides;stichopus;liver neoplasms;cell proliferation

R151.3

A

1008-0341(2013)04-0299-04

10.11712/qlyx201304006

2013-02-03;

2013-05-24

国家自然基金资助项目(002-002395)

金岩(1986-),女,在读硕士研究生。

宋扬(1968-),男,博士,教授,硕士生导师。