5-Aza-dc对宫颈癌细胞系FAM9C基因表达及甲基化影响

于啸,张婷,杨晨曦,王言奎

(青岛大学医学院附属医院妇产科,山东青岛 266003)

5-Aza-dc对宫颈癌细胞系FAM9C基因表达及甲基化影响

于啸,张婷,杨晨曦,王言奎

(青岛大学医学院附属医院妇产科,山东青岛 266003)

目的探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-Aza-dc)对宫颈癌细胞系抑癌基因FAM9C表达及甲基化状态的影响。方法常规培养高危型人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌细胞系HeLa、Caski和HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A,分别用5、10、15μmol/L的5-Aza-dc作用3、5、7 d,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测FAM9C基因表达,甲基化特异性PCR(MSP)方法检测基因启动子区甲基化状态。结果未经5-Aza-dc处理的HPV阳性宫颈癌细胞系FAM9C基因呈低表达,基因启动子区表现为完全甲基化状态;未经5-Aza-dc处理的HPV阴性宫颈癌细胞系FAM9C基因表达水平较高,基因启动子区呈不完全甲基化和非甲基化状态。10或15μmol/L的5-Aza-dc作用5 d时,HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、Caski的FAM9C基因表达显著上调,基因启动子区由完全甲基化转变为不完全甲基化和非甲基化状态;HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A应用5-Aza-dc处理前后FAM9C基因表达及启动子区甲基化状态无明显变化。结论HPV诱导异常甲基化可能是宫颈癌细胞系FAM9C基因表达降低甚至沉默的主要原因;甲基转移酶抑制剂5-Aza-dc能逆转FAM9C基因甲基化状态,使该基因重新表达。

宫颈肿瘤;人乳头瘤病毒;DNA甲基化;5-氮杂-2’脱氧胞苷

DNA甲基化是目前表观遗传学研究的热点,基因突变、染色体物质缺失以及基因启动子区异常甲基化被认为是抑癌基因功能失活的重要机制。高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染被认为是导致宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌发生的重要原因[1]。HPV通过诱导抑癌基因异常甲基化而导致其功能失活可能是HPV致癌机制之一[2-3]。5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-Aza-dc)是一种类核苷甲基转移酶抑制剂,可与DNA甲基转移酶共价结合抑制其活性,逆转基因甲基化状态,使因甲基化而沉默基因重新表达。本课题组前期研究自宫颈癌细胞系筛选出可能因HPV诱导高甲基化而沉默的抑癌基因FAM9C,该基因编码的蛋白与细胞核定位信号相关,其表达缺失与染色体异常有关。本实验探讨了5-Aza-dc对FAM9C基因表达以及甲基化状态的影响,旨在为5-Aza-dc有效逆转宫颈癌细胞系基因甲基化状态寻找最佳作用浓度和时间提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa及HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3,由青岛大学医学院微生物学实验室保存;HPV16阳性宫颈癌细胞系Caski,购自中国医学科学院肿瘤研究所;HPV阴性宫颈癌细胞系C-33A,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DMEM培养液、TRIzol和胎牛血清均购自GIBCO公司;D-Hanks粉剂购自Hyclone公司;5-Aza-dc、氢醌和亚硫酸氢钠购自Sigma公司。RNeasy Mini试剂盒、Quantifast SYBR Green PCR试剂盒和QIAEXⅡDNA回收试剂盒均购自QIAGEN公司;Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒购自Fermentas公司;HotStart TaqDNA聚合酶等PCR相关试剂购自Ta KaRa公司;饱和酚、氯仿及无水乙醇等均为国产试剂;引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 细胞培养及药物处理

用含体积分数0.10胎牛血清、100 k U/L青霉素和200 mg/L链霉素的DMEM培养基,于37℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养HeLa、Caski、HT-3和C-33A细胞系。取对数生长期的上述4种细胞接种至75 cm2细胞培养瓶,细胞贴壁后分别加入5、10、15μmol/L的5-Aza-dc,分别作用3、5、7 d,每24 h换含相同浓度药物的培养液1次。以未经5-Aza-dc处理的细胞系作为对照组。5-Aza-dc作用结束后胰蛋白酶消化单层细胞,D-Hanks液洗细胞2次,离心收集细胞沉淀。

1.3 核酸提取及DNA亚硫酸氢盐修饰

酚-氯仿-异戊醇法常规提取细胞DNA,超纯水溶解,紫外线分光光度法测定各样品DNA浓度。取5μg细胞DNA,加3.3μL新鲜配制的3 mol/L NaOH溶液混匀变性,37℃水浴15 min,加333μL新鲜配制的亚硫酸氢盐溶液(2.4 mol/L亚硫酸氢钠,3 mol/L NaOH和10 mmol/L氢醌的混合液), 55℃避光孵育4 h进行DNA亚硫酸氢盐修饰。采用DNA回收试剂盒对修饰后的DNA进行脱盐纯化处理。将处理后DNA溶于50μL TE溶液中,室温静置5 min,加入3 mol/L NaOH 5.56μL,37℃水浴15 min,使其脱磺化基团。再加入9 mol/L NH4OAC(p H 7.0)27.78μL,3 mol/L NaOAC (p H 5.2)50μL,采用DNA回收试剂盒再次回收纯化,将纯化后的DNA溶解于100μL TE溶液中,置－20℃保存,用于甲基化特异性PCR(MSP)检测。

1.4 FAM9C基因表达检测

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法。使用TRIzol一步法提取细胞总RNA,RNeasy Mini试剂盒纯化,参照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA作为PCR模板,－20℃保存,1周内使用。采用qRT-PCR方法分别检测He La、Caski、HT-3和C-33A细胞系在不同5-Aza-dc浓度和时间作用下FAM9C基因表达水平,以未经5-Aza-dc处理的细胞系为对照组,并设立空白对照。应用Prime premier 5软件设计特异性引物,FAM9C基因上游引物序列为:5′-CAAGGACCAGTTGGAGGTTC-3′,下游引物序列为:5′-TACTGGATCCTTTCCTGCAA-3′,应用罗氏Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪进行扩增和数据分析。qRT-PCR反应体系为20μL,包括:2×Quantifast SYBR Green PCR混合液10μL,上、下游引物0.5μmol/L,无RNase水6μL,模板cDNA 2μL。反应条件为:95℃预变性15 min;94℃变性15 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循环40次;每次循环结束后进行荧光检测;同时扩增GAPDH作为内参照基因。扩增结束后, 95℃1 min,55℃30 s后逐步升温至95℃进行融解曲线分析,确定扩增产物的特异性。测定各样本反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数(Ct),每个样品均重复检测3次,取其Ct均值。采用2－△△Ct相对定量法[4]分析目的基因在各组细胞中表达差异,其中△Ct＝目的基因Ct－内参照基因Ct,△△Ct＝处理组△Ct－对照组△Ct。

1.5 FAM9C基因启动子区甲基化状态检测

采用MSP方法,检测He La、Caski、HT-3和C-33A细胞系在5-Aza-dc不同浓度和时间作用下FAM9C基因启动子区甲基化状态,以未经5-Azadc处理的细胞系为对照组,并设立阴性对照。应用Methprimer软件设计甲基化特异性引物(M),上游引物序列为:5′-TTTATGTCGTTCGTTATTTGTATGC-3′,下游引物序列为:5′-AACCTAAATCCTCTATTCTCACGAA-3′,产物长103 bp;非甲基化特异性引物(U),上游引物序列为:5′-ATGTTGTTTGTTATTTGTATGTGT-3′,下游引物序列为:5′-AACCTAAATCCTCTATTCTCACAAA-3′,产物长100 bp。MSP反应体系25μL,包括:亚硫酸氢盐修饰的DNA模板2μL,热启动DNA聚合酶1 U,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 nmol/L d NTP和0.6 mmol/L引物。MSP反应条件为:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,共循环35次;最后72℃延伸10 min。扩增产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外线凝胶成像系统观察结果。

1.6 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析,FAM9C基因各时间、浓度组间表达差异比较采用析因设计方差分析,组间比较采用LSD法,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5-Aza-dc不同浓度、不同作用时间对宫颈癌细胞系FAM9C基因表达影响

融解曲线分析显示,qRT-PCR基因扩增产物呈单峰,为特异性扩增,空白对照无扩增。未经5-Azadc处理的对照组HPV阳性宫颈癌细胞系He La和Caski细胞系FAM9C基因均呈低表达;不同浓度5-Aza-dc作用不同时间后其表达均有不同程度的上调,其中10μmol/L 5-Aza-dc作用5 d组He La细胞系FAM9C基因表达上调最为明显,差异有显著性(F＝4.044,P＜0.05);15μmol/L 5-Aza-dc作用5 d时Caski细胞系FAM9C基因表达上调最为显著,差异有显著意义(F＝5.486、4.022,P＜0.05)。HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3和C-33A细胞5-Aza-dc作用前后,FAM9C基因表达差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

2.2 FAM9C基因启动子区甲基化状态

未经5-Aza-dc处理的对照组He La和Caski细胞系FAM9C基因只有甲基化特异性引物(M)扩增出条带,其基因启动子区表现为完全甲基化状态; HPV阴性宫颈癌细胞HT-3甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物均扩增出条带(M＋U),基因启动子区为不完全甲基化状态;C-33A细胞系仅非甲基化特异性引物扩增出条带(U),基因启动子区为非甲基化状态。5-Aza-dc处理后,HeLa和Caski细胞系FAM9C基因启动子区甲基化程度降低,由完全甲基化转变为不完全甲基化和非甲基化状态; HPV阴性宫颈癌细胞系5-Aza-dc作用前后甲基化状态无明显改变(图1)。

3 讨 论

肿瘤发生多伴随抑癌基因的功能减弱或沉默,抑癌基因启动子区异常甲基化被认为是除突变和缺失以外抑癌基因功能失活的关键机制,与基因表达沉默有一定相关性[5-7]。约90%的宫颈癌组织中可以检测到HPV存在,而HPV感染通过表观遗传学机制诱导宿主细胞抑癌基因高甲基化,导致抑癌基因表达沉默,可能是HPV促进宫颈癌发生发展的机制之一[8-9]。以5-Aza-dc为代表的类核苷甲基转移酶抑制剂,通过与DNA甲基转移酶共价结合抑制其活性,降低基因甲基化水平,已广泛应用于逆转肿瘤细胞的异常甲基化,诱导由于甲基化而沉默的肿瘤抑制基因重新表达,抑制肿瘤细胞生长,从而达到杀伤肿瘤细胞的效应。5-Aza-dc这种逆转基因甲基化水平的作用,为研究甲基化对基因表达的影响提供实验基础。

表1 不同浓度5-Aza-dc作用不同时间宫颈癌细胞系FAM9C基因相对表达量比较±s)

时间(t/d)浓度(c/ μmol·L－1)HeLa Caski HT-3 C-33A 3 5 1.738±0.405 1.384±0.283 1.131±0.051 1.080±0.085 10 2.451±0.392 1.455±0.062 0.853±0.175 0.867±0.068 15 2.368±0.437 1.734±0.203 0.883±0.030 0.917±0.075 5 5 1.985±0.215 1.562±0.205 0.859±0.062 1.128±0.112 10 2.186±0.532 1.801±0.152 1.041±0.038 1.636±0.263 15 1.746±0.418 1.992±0.246 0.630±0.211 0.998±0.096 7 5 1.304±0.190 1.263±0.128 0.676±0.141 1.786±0.112 10 2.345±0.361 1.451±0.201 0.939±0.049 0.663±0.091 _________15___1.981±0.493 1.651±0.248 0.769±0.07____________ 4 1.039±0.085

我们前期研究应用基因芯片技术自宫颈癌细胞系筛选出可能由HPV诱导高甲基化而沉默的抑癌基因FAM9C,该基因位于Xp22.2,其编码蛋白与细胞核定位信号相关。有研究认为,FAM9C表达缺失与染色体异常有关,但具体功能尚未明确[10]。本研究通过应用不同浓度5-Aza-dc作用不同时间处理HPV阳性宫颈癌细胞系He La、Caski和HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A,探讨5-Aza-dc作用对FAM9C基因表达以及甲基化状态的影响。结果显示,未经5-Aza-dc处理的HPV阳性He La和Caski宫颈癌细胞系FAM9C基因均呈低表达,不同浓度5-Aza-dc作用不同时间后该基因均有不同程度的表达上调;5-Aza-dc处理He La和Caski细胞系可降低FAM9C基因启动子区甲基化状态,变为不完全甲基化状态,该基因表达与启动子区甲基化状态存在负相关关系;5-Aza-dc作用HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3和C-33A细胞前后,FAM9C基因表达及启动子区甲基化状态均无明显变化,提示FAM9C基因的沉默可能与HPV作用有关,HPV可能诱导该基因的高甲基化。5-Aza-dc作用可逆转HPV阳性He La和Caski宫颈癌细胞系FAM9C基因的甲基化状态,诱导该基因的表达水平升高,其中以10、15μmol/L浓度组作用5 d效果较为明显。

综上所述,5-Aza-dc可逆转基因甲基化状态,使基因重新表达,不同浓度5-Aza-dc作用不同时间后对基因表达影响不同。通过对5-Aza-dc影响宫颈癌细胞FAM9C基因表达及甲基化状态的分析,可为5-Aza-dc处理宫颈癌细胞系逆转基因甲基化状态寻找最佳作用浓度和作用时间提供实验依据。对HPV相关肿瘤表观遗传学的深入研究有助于阐明HPV在宿主细胞基因甲基化发生中的作用机制。

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(本文编辑 黄建乡)

EFFECT OF 5-Aza-dc-2’-DEOXYCYTIDINE ON THE EXPRESSION AND METHYLATION OF FAM9C GENE IN CERVICAL CANCER CELL LINES

YU Xiao,ZHANG Ting,YANG Chenxi,WANG Yankui (Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 5-Aza-dc-2’-deoxycytidine(5-Aza-dc)on the expression and methylation of FAM9C gene.MethodsHPV-positive cervical cancer cells(He La and Caski)and HPV-negative cervical cancer cells(C-33A and HT-3)were cultured with different doses of 5-Aza-dc(5,10 and 15μmol/L)for different time,3 days,5 days and 7 days,respectively.Gene expression was detected by using fluorescent quantitative real-time PCR and methylation status of gene promoters by methylation-specific PCR.ResultsIn HPV-positive cervical cancer cell line that not yet treated with 5-Aza-dc, FAM9C gene showed low expression and its promoters were completely methylated;in HPV-negative that not yet treated with 5-Aza-dc,the expression of FAM9C was higher,and incompletely methylated or non-methylated promoters were observed.The expression of FAM9C gene in HPV-positive cervical cancer cells significantly increased with 10 or 15μmol/L 5-Aza-dc treatment for 5 days.Gene promoters reversed to incompletely methylated or non-methylated from complete methylation.The expression and methylation status of FAM9C gene were not significantly changed in HPV-negative cervical cancer cells－before and after treatment with HT-3,C-33A and 5-Aza-dc.ConclusionHPV-induced abnormal methylation is probably a main cause of decreased expression or even silent of FAM9C gene;methyltransferase inhibitor 5-Aza-dc can invert the methylation status of the gene and make it to re-express.

uterine cervical neoplasms;human papillomavirus;DNA methylation;5-Aza-dc-2’-deoxycytidine

R711

A

1008-0341(2013)04-0292-04

10.11712/qlyx201304004

2013-02-26;

2013-06-03

国家自然科学基金资助项目(No.81172480)

于啸(1986-),女,在读硕士研究生。

王言奎(1960-),男,硕士,教授,博士生导师。