刺参酸性黏多糖对人肝癌Hep G2细胞线粒体膜电位及钙离子浓度的影响

陈沉,金岩,宋扬

(青岛大学医学院营养研究所,山东青岛 266021)

·肿瘤学研究·

刺参酸性黏多糖对人肝癌Hep G2细胞线粒体膜电位及钙离子浓度的影响

陈沉,金岩,宋扬

(青岛大学医学院营养研究所,山东青岛 266021)

目的观察刺参酸性黏多糖(SJAMP)体外诱导人肝癌细胞Hep G2凋亡的情况,探讨SJAMP对HepG2细胞线粒体凋亡途径相关膜电位作用机制。方法体外培养人肝癌细胞HepG2,用不同浓度的SJAMP (0.25、1.00、4.00 mg/L)对其进行干预,应用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变,Fura-2荧光显微镜检测细胞钙离子浓度改变。在相同条件下干预人正常肝细胞(张氏细胞)以观察其对正常细胞的影响。结果随着SJAMP剂量的增加,Hep G2细胞内钙离子浓度及线粒体膜电位均降低,各干预组与空白对照组比较、各干预组间比较差异均有显著性(F＝183.36、264.24,q＝3.26～35.67,P＜0.05);而张氏细胞各干预组钙离子浓度及线粒体膜电位(除0.25 mg/L SJAMP作用组线粒体膜电位高于其他组外)差异无统计学意义(P＞0.05)。结论SJAMP可能通过降低细胞内钙离子浓度和细胞线粒体膜电位,诱导线粒体通透性的改变,启动细胞凋亡途径。

肝肿瘤;HepG2细胞;刺参属(动物);多糖;细胞凋亡

原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一,具有发病率高、发现晚、恶化率高等特征,严重威胁人类生命健康。由于现有抗肝肿瘤化学药物副作用较大,越来越多的研究人员将抗肿瘤研究转向自然环境中高效低副作用的多糖类物质[1]。刺参酸性黏多糖(SJAMP)是刺参体壁真皮结缔组织中的一种生物活性结缔组织多糖,众多研究显示,其具有抗肿瘤、免疫调节及促细胞生长等多种活性作用[2-4]。线粒体膜电位的改变是细胞线粒体凋亡途径的重要起始阶段,由于线粒体膜电位改变引起线粒体通透性变化,进一步释放出细胞色素C等促凋亡因子,促使细胞凋亡。本实验通过检测SJAMP对Hep G2细胞线粒体膜电位相关指标的影响,为进一步探讨SJAMP促细胞凋亡作用提供初步理论依据。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人肝癌细胞株HepG2细胞及人正常肝组织细胞(人张氏肝细胞),由中国科学院上海生命科学院细胞研究所提供,使用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM、1640培养液,在37℃、体积分数0.05 CO2孵箱中培养[5]。

1.2 荧光显微镜检测细胞内钙离子浓度

取对数生长期的Hep G2细胞以及人张氏肝细胞,以1×109/L的密度接种于6孔培养板中,细胞贴壁后,弃上清,各组分别加入终浓度为0.25、1.00、4.00 mg/L的SJAMP,以不加SJAMP者作为空白对照组,孵育24 h后进行细胞内钙离子检测。将含有2μmol/L Fura-2 AM的适当溶液和细胞一起在37℃条件下孵育30 min,完成荧光探针的装载。PBS洗涤2次,严格按照试剂盒说明书操作,绿色荧光代表被结合的钙离子。用奥林巴斯公司提供荧光显微镜观察,激发波长340 nm,发射波长510 nm,采用Imagepro-plus软件进行荧光分析,以Integral Optical Density(IOD)值表示钙离子浓度。

1.3 流式细胞仪检测线粒体膜电位

取对数生长期的细胞,以1×109/L的密度接种于6孔培养板中,细胞贴壁后,弃上清,各组分别加入浓度为0.25、1.00、4.00 mg/L的SJAMP,孵育24 h后用2.5 g/L胰酶收集所有细胞,再将细胞吹打均匀,制成单细胞悬液,用PBS调整细胞密度至1×1012/L,加入染色剂JC-1(终浓度为5 mg/L), 37℃避光20 min,弃上清,PBS洗2次,用PBS溶液重悬沉淀,流式细胞仪检测JC-1单体(激发波长490 nm,发射波长530 nm)和JC-1聚合物(激发波长525 nm,发射波长590 nm),用荧光强度值表示线粒体膜电位[6]。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度SJAMP对细胞内钙离子浓度影响

SJAMP作用与非作用的HepG2细胞内都有钙离子的存在,与Fura-2荧光染料结合后显蓝绿色荧光。随着SJAMP浓度的增加,HepG2细胞内钙离子浓度逐渐下降,各剂量组与空白对照组、各剂量组之间比较,差异均有统计学意义(F＝183.36,q＝6.44～27.01,P＜0.05);而人张氏肝细胞内的钙离子浓度没有明显改变(P＞0.05)。见表1。

2.2 不同浓度SJAMP对线粒体膜电位的影响

随着SJAMP浓度的增加,Hep G2细胞线粒体膜电位逐渐下降,各剂量组与空白对照组、各剂量组之间比较,差异均有显著性(F＝264.24,q＝3.26～35.67,P＜0.05);而人张氏肝细胞线粒体膜电位除低剂量组(0.25 mg/L)高于其他组外,其他各组比较差异无显著性(P＞0.05)。见图1、2,表2。

表1 不同浓度SJAMP对HepG2及人张氏肝细胞钙离子浓度的影响(n＝3,IOD±s)

SJAMP浓度(ρ/mg·L－1)___Hep G2细胞_____________________人张氏肝细胞0 115.33±5.13 62.35±2.31 0.25 81.67±3.76 79.42±3.01 1.00 64.33±3.51 75.22±2.08 ____________4.00_______________________________________________ 44.00±2.64 72.33±3.51

表2 不同浓度SJAMP对HepG2细胞及人张氏肝细胞线粒体膜电位的影响(n＝3±s)_______________________

SJAMP浓度(ρ/mg·L－1)___Hep G2细胞_____________________人张氏肝细胞0 62.82±4.64 19.92±0.62 0.25 22.11±2.13 21.36±0.84 1.00 12.63±1.43 19.48±0.18 ___________4.00_____________________________________________ 7.89±0.55 19.75±0.33

3 讨 论

凋亡或称程序性细胞死亡,是一种受基因调节的自主控制过程,在生物个体发育和生存中起着非常重要的作用。已有研究表明,线粒体是细胞凋亡调控的活动中心,Ca2＋-cytc-caspase-3信号介导的线粒体凋亡通路是公认的经典凋亡途径[8]。线粒体外膜通透性增加及膜间凋亡分子释放,是决定凋亡起始的关键步骤[9]。细胞钙离子浓度降低引起跨膜电位下降,将会引起线粒体膜通透性改变,导致促凋亡物质的释放及Caspase家族激活,促使细胞凋亡。多数细胞凋亡时跨膜电位均会下降,这种改变发生于细胞凋亡形态学改变之前,提示跨膜电位的改变为细胞凋亡过程中的早期阶段[10]。

SJAMP具有抗肿瘤活性,能够抑制恶性肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡,但是其抗肿瘤的分子机制尚处研究阶段。我们前期研究显示,SJAMP作用于Hela细胞后,各干预组的细胞周期蛋白PCNA表达量均下调,且随着SJAMP浓度的增大及作用时间的延长,各干预组中caspase-3及caspase-9的表达均有增加趋势,说明SJAMP能通过抑制细胞增殖及促进细胞凋亡两种方式抗肿瘤[11-12]。

本研究结果显示,随着SJAMP剂量的增加,肝癌细胞株Hep G2细胞内的钙离子浓度及线粒体膜电位逐渐降低,而人张氏肝细胞株并没有明显改变,提示SJAMP作用于Hep G2细胞后,可能会引起细胞钙离子浓度的降低及线粒体膜电位的下降,使线粒体内外通透性改变,从而启动细胞凋亡途径。本文结果与张延坤等[13]和安超等[14]研究结果相似。

人张氏肝细胞是人永生化的肝细胞株,具有人类正常肝细胞的各种特征,本研究使用张氏肝细胞作为正常肝细胞对照组,以探讨SJAMP对正常肝细胞的影响。结果显示,在与Hep G2细胞相同剂量SJAMP作用下,人张氏肝细胞各干预组线粒体膜电位并没有表现出类似于HepG2细胞干预组的明显改变,除低剂量组(0.25 mg/L)线粒体膜电位高于其他组外,其他各组比较差异均无显著性,说明SJAMP对人张氏肝细胞的线粒体膜电位及细胞钙离子浓度无影响。对于低剂量(0.25 mg/L)SJAMP作用组线粒体膜电位高于其他组,其原因可能为:①线粒体膜电位改变时,电子传递链会漏出少量的电子,这类电子能直接和氧形成超氧自由基进一步衍生为活性氧(ROS),而ROS能够引发细胞氧化应激,引起细胞损伤,导致线粒体膜电位的紊乱[15];②线粒体膜电位的改变迅速而敏感,人张氏肝细胞对于SJAMP的敏感浓度范围可能过小。陈尉华等[15]的研究结果显示,药物浓度过低对人张氏肝细胞的干预作用不明显,而过高会渐渐出现抑制作用。故本研究低剂量(0.25 mg/L)SJAMP干预组人张氏肝细胞线粒体膜电位的变化,可能是由于诱发了细胞氧化应激反应,或其浓度恰好处于人张氏肝细胞的敏感浓度范围之内而产生的,其发生的具体原因亟待进一步研究。

总之,SJAMP能够诱导肝癌细胞株HepG2细胞内钙离子浓度降低及线粒体膜电位下降,说明其具有诱导肿瘤细胞线粒体起始凋亡途径的作用。

[1]孙希宝,王宝磊,刘家宏,等.刺参黏多糖诱导人肝癌细胞凋亡的实验研究[J].国际外科学杂志,2010,37(5):303-306.

[2]胡人杰,于苏萍,姜卉,等.刺参粘多糖及考的松对小鼠移植瘤S180的作用[J].中国肿瘤临床,1992,19(1):72-75.

[3]王静凤,逄龙,薛勇,等.日本刺参酸性粘多糖、皂苷和胶原蛋白多肽对血管内皮细胞的保护作用[J].中国药理学通报, 2008,24(2):227-232.

[4]高巍.刺参酸性粘多糖增效作用评价及作用机制初探[D].天津:天津医科大学,2006:1-63.

[5]陈玲,于壮,宋扬.刺参黏多糖对人宫颈癌细胞凋亡的影响[J].齐鲁医学杂志,2009,24(2):95-96.

[6]夏国华,陈宝安,芦慧霞,等.荧光探针JC-1检测骨髓增生异常综合征细胞凋亡早期线粒体膜电位的变化[J].中华检验医学杂志,2007,30(8):923-926.

[7]张帅,崔隽,沈萍萍.细胞凋亡中的钙离子调控[J].细胞生物学杂志,2007,29(6):785-790.

[8]方敏,王晓东.细胞凋亡的线粒体通路[J].北京大学学报:医学版,2002,34(1):1-10.

[9]孙恒文.肝癌细胞凋亡诱导因子与辐射敏感性的关系研究[D].广州:南方医科大学,2009:1-116.

[10]赵文静,牛凤兰.3,4,5-三羟基苯甲酸通过线粒体途径诱导人肝癌细胞SMMC-7721的凋亡[J].

高等学校化学学报,2009,30(2):320-323.

[11]张笑雪,于壮,宋扬.刺参黏多糖对Hela细胞PCNA表达及细胞周期的影响[J].山东医药,2008,48(46):19-21.

[12]王颖,于壮,宋扬.刺参黏多糖对人宫颈癌Hela细胞caspase表达影响[J].齐鲁医学杂志,2008,23(3):191-194.

[13]张延坤,张东祥.生物活性多糖的抗肿瘤作用及其机制研究进展[J].解放军预防医学杂志,2006,24(5):382-385.

[14]安超,农一兵,温志浩,等.黄芪皂苷和黄芪多糖对乳鼠肥大心肌细胞线粒体膜电位的影响[J].北京中医药大学学报:中医临床版,2009,16(3):17-19.

[15]陈尉华,徐中南,陆伦根,等.异甘草酸镁对培养肝细胞增殖影响的实验研究[J].肝脏,2006,11(1):15-17.

[16]关莉莉,王耀锋,宫德正,等.解偶联蛋白2过表达张氏肝细胞的构建及其对线粒体膜电位和活性氧的影响[J].中华肝脏病杂志,2012,20(2):131-135.

(本文编辑 黄建乡)

EFFECTOFJAPONICUSACIDMUCOPOLYSACCHARIDEONMITOCHONDRIALMEMBRANEPOTENTIALANDCALCIUM IONCONCENTRATIONINHUMANLIVERCANCERHepG2CELLS

CHEN Chen,JIN Yan,SONG Yang (Department of Nutrition,Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China)

ObjectiveTo study the HepG2 cell apoptosis induced by Stichopus japonicus acidic mucopolysaccharide (SJAMP)in vitro,and explore the mechanism of changes of its correlated mitochondrial membrane potential.MethodsHepG2 cells cultured in vitro were exposed to different concentrations of SJAMP(0.25,1.00,4.00 mg/L).Flow cytometry was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential,and a fluorescence microscope to measure the calcium ion concentration in the cells.Chang’s liver cells were interfered under the same conditions to observe their influence on normal cells.ResultsWith the increasing of SJAMP dose,the intracellular calcium ion concentration and membrane potential decreased,a comparison between each intervention group and blank control group,as well as between each intervention group,the differences being significant(F＝183.36,264.24;q＝3.26－35.67;P＜0.05).In Chang’s liver cells,the differences of calcium ion concentrations and membrane potential between each intervention group were not significant－except 0.25 mg/L SJAMP action group(P＞0.05).ConclusionSJAMP is likely through decreasing intracellular calcium ion concentration and cell mitochondrial membrane potential,inducing changes of permeability of mitochondrial membrane and initiating the path of apoptosis.

liver neoplasms;HepG2 cells;stichopus;mucopolysaccharide;cell apoptosis

R151.3

A

1008-0341(2013)04-0283-04

10.11712/qlyx201304001

2013-01-13;

2013-05-21

国家自然基金资助项目(002-002395)

陈沉(1987-),男,硕士研究生。

宋扬(1968-),男,博士,教授,硕士生导师。