新型Ca2＋通道TRPV5和TRPV6的研究进展

那 键，马 超，霍维玲，秦瑞云，吴晓东，许 永，王 涛，谷贵山

（1.东南大学医学院附属徐州市中心医院骨关节科，江苏 徐州 221009，2.吉林大学第一医院骨关节科，吉林 长春 130021）

1969年，Cosens和Manning在研究果蝇视觉信号时首先发现了瞬时感受器电位（transient receptor potential，TRP）蛋白。1989年 Montell等第1次克隆出TRP基因，后续的相关研究［1］证明TRP基因可以编码钙通透性阳离子通道。按照其作用和组织分布的差异，TRP目前被分为TRPC、TRPV、TRPM、TRPP、TRPML和TRPN 6个亚家族［2－3］。Melastatin蛋白是一种公认的肿瘤抑制蛋白，M亚家族就是通过这种最先发现的蛋白命名的。V亚家族命名来源于最先发现的成员香草精（Vanilloid）受体I（VRI）。TRPV亚家族共有TRPV1～TRPV66个成员，其中TRPV5和 TRPV6参与钙代谢和调控［3－6］。

1 TRPV5与TRPV6概述

已知的Ca2＋从胞内到胞外跨膜转运机理是由钠－钙交换和Ca2＋－ATP酶这2种途径进行的，但尚不清楚细胞外Ca2＋向细胞内的跨膜运输机制。1999年Hoenderop等［7］在对Xenopus光滑卵母细胞Ca2＋跨膜运输机制的研究发现了全新的Ca2＋跨膜运输通道蛋白。随后一系列深入研究进一步证明这种通道最主要存在于在肾脏和小肠上皮细胞中，为TRPV亚家族成员，故分别命名为TRPV5和TRPV6。TRPV5及TRPV6在兔、鼠和人等多个物种中均有表达，并且表现出蛋白序列的高度同源性。研究显示：在肾脏远曲小管（DCT）和集合小管（CNT）中存在TRPV5的强势表达，TRPV5主要存在于上皮细胞管腔侧，主要作用为对尿钙主动重吸收，维护体内钙环境稳态和机体钙参与的各种功能。通过免疫化学方法证实了破骨细胞吸收面的毛刷状缘存在TRPV5优势表达，由此推断TRPV5可能与破骨细胞对骨吸收和细胞中 Ca2＋运输关系密切［8］。研究［9－10］显示：将TRPV5＋／＋大鼠破骨细胞接种在大鼠胫骨皮质上出现了较明显的骨吸收陷窝，而在TRPV5－／－大鼠破骨细胞未出现明显的骨吸收陷窝，并且出现代偿性的破骨细胞体积和数量增大，这被认为是功能缺陷的一种代偿，也说明了TRPV5参与骨吸收的作用与骨质疏松症（OP）发生有密切相关性。有实验证明了在胃肠道中存在TRPV6的优势表达，并证实了其作用为对食物中钙的吸收。在胰腺β细胞胞浆分泌粒中存在TRPV5优势表达，其作用为维护胞内钙稳态和介导胰岛素分泌及胞吐作用［3］。研究［11－12］显示：对维生素D受体（VDR）基因敲除小鼠进行转TRPV6基因时，即使敲除了VDR基因，也不影响Ca2＋的吸收，证明小肠上皮细胞对Ca2＋的吸收主要在于TRPV6Ca2＋通道。并由钙结合蛋白calbindin－D（9K）和Ca2＋浓度共同参与调节。Kennedy等［13］在对视网膜色素上皮细胞（RPE）中 TRPV5和TRPV6表达规律研究中证明了感受光线明／暗转换的机制，光线照射RPE可以启动细胞膜上的TRPV5和TRPV6通道，介导Ca2＋内流，调节视网膜下腔（SRS）Ca2＋浓度，完成对光线强弱的的感知。Yang等［14］研究发现：雌激素介导下的TRPV6和与Ca2＋ATP酶活性相关蛋白质编码基因PMCA1共同表达，可以调控女性子宫内膜在月经周期中的变化，参与人体生殖功能调节。Weissgerber等［15］研究证明：在附睾上皮细胞膜也存在TRPV6通道，且与男性生育能力密切有关。

2 TRPV5和TRPV6的结构及电生理特性

人类的TRPV5基因位于染色体7q35，其编码5729个氨基酸组成的多肽。基因存在4个可能是1，25－二羟维生素D3调控TRPV5的转录结合位点的D3反应元件，这些元件对TRPV5mRNA的表达进行调控。在启动子区域也发现多个与转录相关的激活因子结合位点，例如刺激蛋白1（SP1）、激活蛋白1（AP1）和激活蛋白2（AP2）等［3］。TRPV5和TRPV6基因编码的通道蛋白在多物种均有高度的同源性，包括羧基端和氨基端均位于细胞内的相同的6次跨膜多肽亚单位（6TM）。跨膜区5（S5）与跨膜区6（S6）之间的疏水区片段构成离子通道区。TRPV5及TRPV6的氨基末端存在推测为激素作用于Ca2＋通道的重要靶点的1个锚蛋白重复序列和蛋白激酶C（PKC）的3个磷酸化位点。在羧基端存在1个可以同PDZ功能区相结合的PDZ（PSD295discs－largeandZO－1）结构域，是重要的蛋白－蛋白结合作用区域，其可能在调控TRPV5蛋白的运输方面起着关键作用。TRPV5在羧基末端存在TRPV6不具有的3个PKC磷酸化位点。TRPV5和TRPV6蛋白锚固作用是通过锚蛋白与细胞黏附分子连接完成的。TRPV5和TRPV6钙通道生物膜电位的变化表现出高度Ca2＋选择性。对HEK293细胞Ca2＋电位的研究显示：生理条件下正常膜电位为－70mV，当受电压依赖的Ca2＋内流刺激后，TRPV5和TRPV6表现出与细胞外Ca2＋浓度相关的巨大内向电流，呈现较强的正电位。电位接受Ca2＋的负反馈调节，电位失活表现为一个超极化的过程。TRPV5在整个过程中都表现为一个缓慢失活的过程，TRPV6先是一个快速失活过程，随后是一个缓慢失活的过程。

3 TRPV5和TRPV6的调控因素

雌激素对TRPV5具有调节作用［16］，女性绝经期后雌激素缺乏可以导致骨量的减少，雌激素缺乏可以导致尿中Ca2＋增多，证明雌激素增加了肾脏的Ca2＋重吸收作用，已知肾脏于近曲小管和远曲小管内存在雌激素受体，绝经期后由于雌激素分泌水平下降，作用于肾脏雌激素受体不足，导致对Ca2＋重吸收调节的作用减弱，但是具体调节机制尚不清楚。研究显示：大鼠TRPV5基因及大鼠钙结合素D28k基因启动子中存在雌激素反应性区；也发现了雌激素通过成骨细胞和破骨细胞上雌激素受体α（ERα）促进骨重建和诱导破骨细胞凋亡，同时抑制JNK（一种MAKP信号转导通路）的活性，减少c－fos和c－jun的表达水平，使其与DNA的结合减少，进而抑制由RANKL介导的破骨细胞的分化［17］。Monique等［18］研究显示：17－β雌二醇可以上调大鼠TRPV5mRNA的表达。雌激素通过刺激TRPV5的表达促进Ca2＋的重吸收［19］。这与女性绝经前骨质疏松的发病少于男性相一致［3］。有关VDR和钙结合Calbindin－D28基因敲除小鼠的研究显示：TRPV5和TRPV6在Calbindin－D28敲除鼠中表达无变化，而在VDR敲除鼠和双基因敲除鼠中下调的幅度相当。高钙饮食条件下VDR和双基因敲除小鼠的Ca2＋水平正常［20］。结果证明了Calbindin－D28的缺失对TRPV5和TRPV6基因表达无影响，但受Ca2＋和维生素D双重调节。在细胞的各种生理调节过程中Ca2＋作为第二信使起着至关重要的作用，刺激前列腺特异性G蛋白偶联受体（PSGR）可以提高细胞内Ca2＋浓度和抑制前列腺细胞的增殖。内源性的TRPV6通道积极参与PSGR诱导的Ca2＋信号传递，TRPV 6介导的Ca2＋内流依赖于Src激酶活性［21］。1，25－二羟维生素D3对Ca2＋代谢起重要的调节作用［16，22－23］，可以协同雌激素增加肾脏 TRPV5基因表达，对编码25羟维生素D3的1α羟化酶基因的特异性位点进行精确正反馈调控，促进1，25－二羟维生素D3在肾脏的合成。已知TRPV5存在4个1，25－二羟维生素D3反应元件，推测其可能是1，25－二羟维生素D3调控TRPV5的转录结合位点。通过小鼠维生素D3饮食实验证实了1，25－二羟维生素D3对TRPV5和TRPV6的敏感性［20］。定量PCR结果显示：经1，25－二羟维生素D3干预的小鼠，TRPV5表达量比对照组高3倍，肠TRPV6的表达则比对照组增加6倍［24］。有关前列腺癌的研究［25］显示：在低雌激素存在条件下，1，25－二羟基维生素D3可以上调TRPV6的表达，并通过增加进入S期的细胞数目促进细胞增殖。这些促增殖作用是由1，25－二羟维生素D3作用于LNCaP细胞介导TRPV6通道增加钙的吸收完成的。而在雄激素非依赖性LNCaP细胞，1，25－二羟维生素D3的调节作用被消弱。组织转谷氨酰胺酶（tTG）是一种多功能的Ca2＋依赖酶，其作用是催化蛋白质交联。TG在角质形成细胞中调节TRPV通道的活动，对皮肤屏障的形成作出贡献。在肾脏，TRPV5占主导地位，使用膜片钳观察到TRPV5经tTG处理后通道的孔径减少，提示TRPV5结构发生变化。进一步研究显示：其作用机制是TRPV5通道N－糖基化后功能失活，这些观察结果提示tTG作为一种新的胞外酶抑制TRPV5的活性。这也许是TRPV5抑制方式的一个共同的最终途径［26］。有研究［27］表明：钙结合蛋白和NCX1mRNA表达水平在TRPV5－／－小鼠中降低，而且1，25－二羟维生素D3干预后仍然不能增加其表达。说明TRPV5与NCX1和 Calbindin－D28k的表达有关联［3］。有研究［16，28］证实： 免疫抑制剂FK506作用于肾脏可以减少TRPV5mRNA表达，地塞米松可以上调肾脏TRPV5mRNA表达，二者的作用机制目前尚有待研究。近年来随着对晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）研究的深入，发现AGEs参与多种生理功能过程，80KH磷蛋白作为AGEs的受体（RAGEs），具有介导 AGEs的作用。Gkila等［29－30］研究80KH与TRPV5的关系证实：80KH参与了对TRPV5的调节，80KH中有2个EF臂酸性的谷氨酸序列和HDEL序列作用于TRPV5的C端598～608的氨基酸序列的80KH作用靶点，增强TRPV5通道电流。Lambers等［31］研究显示：调钙蛋白（CaM）能够减少TRPV6通道Ca2＋表达。另有研究表明：CaM活性增高并由细胞骨架上转移到细胞浆内有赖于细胞内Ca2＋浓度增高。其机制是通过Ca2＋与调钙蛋白的氨基端或羧基端EF指结构3和4结合实现的。S100A10是一组低相对分子质量的TRPV5蛋白的钙结合蛋白辅助蛋白，其靶蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ），后者具有Ca2＋依赖性结合磷脂、细胞骨架蛋白的重要特性。vande Graaf等［32］发现了S100A10与AnnexinⅡ形成的聚合体特异性地结合TRPV5羧基末端VATTV序列，促进钙通道对Ca2＋的吸收。mRNA干涉HEK293细胞中AnnexinⅡ表达后，TRPV5介导的电流强度减弱。选择性雌激素受体调节剂他莫昔芬在TRPV6转染非洲爪蟾卵母细胞中抑制钙的吸收，并且这种抑制作用不依赖于雌激素受体，因为即使在雌激素受体阴性的乳腺癌细胞中他莫昔芬也有效［33］，说明他莫昔芬对TRPV6通道存在直接调节作用。

4 展 望

TRPV通道改变与骨代谢疾病的关系已成为骨代谢疾病发病机制研究的新课题。阐明TRPV通道在骨代谢疾病发生发展中的机制以及在成骨细胞中的表达规律对于采取一定的措施在分子生物学水平上进行干预、预防骨质疏松的发生和减缓其疾病进程有重要意义。

［1］Hardie RC，Ninke B.The trp gene is essential for a light activated Ca2＋channel in Drosophila photoreceptors ［J］.Neuron，1992，8（4）：643－651.

［2］Montell C，Birnbaumer L，Flockerzi V，et al. Aunified nomenclature for the super family of TRP cation channels［J］.Mol Cell，2002，9（2）：229－231.

［3］胡东亮，王少刚，叶章群.TRPV5与特发性高钙尿症的研究进展［J］.现代泌尿外科杂志，2008，13（4）：922－925.

［4］Hoenderop JG，van der Kemp AW，Hartog A，et al.Molecular identification of the apical Ca2＋channel in 1，25－dihydroxy vitamin D3responsive epithelia［J］.J Biol Chem，1999，274（13）：8375－8378.

［5］Peng JB，Chen XZ，Berger UV，et al.Molecular cloning and characterization of a channel－like transporter mediating intestinal calcium absorption［J］.J Biol Chem，1999，274（32）：22739－22746.

［6］Woudenberg－Vrenken TE，Lameris AL，Weibgerber P，et al.Functional TRPV6channels are crucial for transepithelial Ca2＋absorption ［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303（7）：G879－G885.

［7］Hoenderop JG，Hartog A，Stuiver M，et al.Localization of the epithelial Ca2＋channel in rabbit kidney and intestine［J］.J Am Soc Nephrol，2000，11（7）：1171－1178.

［8］Eerden BCJ，Hoenderop JGJ，de Vries TJ，et al.The epithelial Ca2＋channel TRPV5is essential for proper osteolastic bone resorption ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（48）：17507－17512.

［9］Bram CJ，van der Eerden，Joost GJ.The epithelial Ca2＋channel TRPV5is essential for proper osteoclastic bone resorption［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（48）：17507－17512.

［10］车明学，李富春，谷贵山.新型Ca2＋通道TRPV5在骨质疏松症发病机制中的作用［J］.中国老年学杂志，2007，27（17）：3370－3372.

［11］Cui M，Li Q，Johnson R，et，al.Villin promoter－mediated transgenic expression of transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 6（TRPV6）increases intestinal calcium absorption in wild－type and vitamin D receptor knockout mice［J］.J Bone Miner Res，2012，27（10）：2097－2107.

［12］Kellett GL. Alternative perspective on intestinal calcium absorption：proposed complementary actions of Ca（v）1.3and TRPV6［J］.Nutr Rev，2011，69（7）：347－370.

［13］Kennedy BG，Torabi AJ，Kurzawa R，et al.Expression of transient receptor potential vanilloid channels TRPV5and TRPV6in retinal pigment epithelium ［J］.Mol Vis，2010，14（16）：665－675.

［14］Yang H，Choi KC，Hyun SH，Coexpression and estrogenmediated regulation of TRPV6and PMCA1in the human endometrium during the menstrual cycle［J］.Mol Reprod Dev，2011，78（4）：274－282.

［15］Weissgerber P，Kriebs U，Tsvilovskyy V. Excision of TRPV6gene leads to severe defects in epididymal Ca2＋absorption and male fertility much like single D541Apore mutation［J］.J Biol Chem，2012，287（22）：17930－17941.

［16］杨 震，秦大明，谷贵山.新型钙通道TRPV与骨代谢的关系［J］.吉林大学学报：医学版，2005，31（4）：645－648.

［17］Huber DM，Bendixen AC，Pathrose P，et al.Androgens suppress osteoclast formation in duced by RANKL and macrophage colony stimulating factor［J］.Endocrinology，2001，1421（9）：3800－3881.

［18］Monique VA，Joost GJ，Hoenderop OD，et al. 1，25－Dihydroxyvitamin D3independent stimulatory effect of estrogen on the expression of ECaC1in the kidney［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13（8）：2102－2109.

［19］van Abel M，Hoenderop JG，Dardenne O，et al. 1，25－dihydroxyvitamin D（3）－independent stimulatory effect of estrogen on the expression of ECaC1in the kidney［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13（8）：2102－2109.

［20］康 红，郑 维，杨进福.上皮钙通道基因在维生素D受体和Calbindin－D28k双基因敲除鼠中的变化［J］.实用预防医学，2007，14（3）：674－677.

［21］Spehr J，Gelis L，Osterloh M.G protein－coupled receptor signaling via Src kinase induces endogenous human transient receptor potential vanilloid type 6（TRPV6）channel activation［J］.J Biol Chem，2011，286（15）：13184－13192.

［22］Hoenderop JG，Muller D，van der Kemp AW，et al.Calcitriol controls the epithelial calcium channel in kidney［J］.J Am Soc Nephrol，2001，12（7）：1342－1349.

［23］Fleet JC，Eksir F，Hance KW，et al.Vitamin D inducible calcium transport and gene expression in three Caco－2cell lines［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2002，283（3）：G618－G625.

［24］van Cromphaut SJ，Dewerchin M，Hoenderop JG，et al.Duodenal calcium absorption in vitamin D receptor－knockout mice：functional and molecular aspects［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（23）：13324－13329.

［25］Lehen＇kyi V，Raphaél M，Oulidi A.TRPV6determines the effect of vitamin D3on prostate cancer cell growth ［J］.PLoS One，2011，6（2）：e16856.

［26］Boros S，Xi Q，Dimke H.Tissue transglutaminase inhibits the TRPV5－dependent calcium transport in an N－glycosylationdependent manner［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（6）：981－992.

［27］Hoenderop JG，van Leeuwen JP，van der Eerden BC，et al.Renal Ca2＋wasting，hyperabsorption，and reduced bone thickness in mice lacking TRPV5［J］.J Clin Invest，2003，112（12）：1906－1914.

［28］NijenhuisT，Hoenderop JG，Bindels RJ.Downregulation of Ca2＋and Mg2＋transport proteins in the cidney explains tacrolimus（FK506） induced hypercalciuria andhypomagnesemia［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15（3）：549－557.

［29］Gkika D，Mahieu F，Nilius B，et al.80KH as a new Ca2＋sensor regulating the activity of the epithelial Ca2＋channel TRPV5［J］.J Biol Chem，2004，279（25）：26351－26357.

［30］Dimitra G，Frank M，Bernd N，et al.80KH as a new Ca2＋sensor regulating the activity of the epithelial Ca2＋channel transient receptor potential cation channel V5（TRPV5）［J］.J Biol Chem，2004，279（25）：26351－26357.

［31］Lambers TT，Weidema AF，Nilius B，et al.Regulation of the mouse epithelial Ca2＋channel TRPV6by the Ca2＋sensor calmodulin［J］.J Biol Chem，2004，279（28）：28855－28861.

［32］van de Graaf SF，Hoenderop JG，Gkika D，et al.Functional expression of the epithelial Ca2＋channels（TRPV5and TRPV6 ） requiresassociation of the S100A10－annexin complex［J］.EMBO J，2003，22（7）：1478－1487.

［33］Bolanz KA，Kovacs GG，Landowski CP.Tamoxifen inhibits TRPV6activity via estrogen receptor－independent pathways in TRPV6－expressing MCF－7breast cancer cells［J］.Mol Cancer Res，2009，7（12）：2000－2010.