白藜芦醇通过核因子-κB信号通路抑制脑缺血基质金属蛋白酶功能上调

朱佳蕾 邓夏珩 高 丽 顾 昊 沈 伟 郭 军

(南京医科大学基础医学实验教学中心，江苏 南京 210029)

白藜芦醇通过核因子-κB信号通路抑制脑缺血基质金属蛋白酶功能上调

朱佳蕾 邓夏珩 高 丽1顾 昊1沈 伟1郭 军2

(南京医科大学基础医学实验教学中心，江苏 南京 210029)

目的揭示白藜芦醇抑制脑缺血基质金属蛋白酶(MMP)-9功能上调的分子机制及其与核因子(NF)-κB信号通路联系。方法建立大鼠四动脉前脑缺血模型，采用免疫印迹技术观察缺血后再灌海马脑区MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位的变化;给予自由基清除剂白藜芦醇或NF-κB抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)，识别NF-κB信号通路是否参与了白藜芦醇对脑缺血MMP-9蛋白表达的调控。结果脑缺血/再灌诱导海马脑区MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位增加(P＜0.05)。PDTC能一定程度的抑制缺血后MMP-9基因表达(P＜0.05)。白藜芦醇能显著抑制脑缺血NF-κB核易位和MMP-9表达上调(P＜0.05)。结论脑缺血再灌，诱导MMP-9依赖NF-κB通路的蛋白水平增加，白藜芦醇能通过抑制NF-κB通路下调MMP-9的功能，继而阻断MMP-9激活介导的胞外基质降解及海马脑区损伤。

脑缺血;白藜芦醇;MMP-9;NF-κB

基质金属蛋白酶(MMPs)是一组活性依赖钙离子和锌离子的中性蛋白酶家族，在体内组成性表达，参与降解各种细胞外基质(ECM)〔1〕。现已识别20多种蛋白，其中MMP-9是MMPs家族的主要成员之一。通过诱导胞外基质异常降解，MMP-9参与了多种神经性疾病的发生，如髓鞘脱失、血脑屏障损伤等，而MMP-9在缺血性脑损伤的精确分子调控机制有待探明。有研究表明:MMP-9的表达上调及功能异常与自由基产生密切相关，且其启动序列具有因子(NF)-κB的识别位点。因而，本研究拟采用具有自由基清除功能的白藜芦醇及NF-κB抑制剂，检测脑缺血后海马脑区自由基生成及NF-κB信号通路对MMP-9基因表达及功能上调的影响，继而揭示天然化合物白藜芦醇能通过NF-κB信号通路抑制MMP-9，阻断缺血后胞外基质降解，保护海马神经细胞的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康成年雄性SD大鼠来自南京医科大学实验动物中心，体重220～250 g，室温下饲养。

1.2 抗体 MMP-9和β-actin抗体来源于武汉博士德生物工程有限公司;NF-κB抗体是Cell Signaling Technology公司产品。

1.3 其他试剂 白藜芦醇购自南京泽朗医药科技有限公司;吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)来源于碧云天生物技术研究所，是国外分装产品。

1.4 方法

1.4.1 前脑缺血模型 采用四动脉阻断法建立前脑缺血模型〔2〕，实验操作过程符合南京医科大学实验动物使用规定。水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠;俯卧位固定大鼠，暴露第2颈椎，电灼两侧椎动脉，造成永久性闭塞;腹侧颈正中切口并分离颈总动脉，丝线标记;电灼24 h后，动脉夹夹住双侧颈总动脉，使大鼠脑部供血完全阻断;10 min后松开动脉夹，再灌注12和24 h。该过程要求大鼠在动脉充分阻断时须满足下列条件:(1)脑电波完全平坦，(2)瞳孔扩张，(3)无角膜反射，(4)直肠温度稳定(约37℃)。对照组大鼠进行相似的外科手术但无动脉阻断。药物注射实验组，腹腔注射自由基清除剂白藜芦醇(200 mg/kg)或相同剂量的生理盐水。每组动物接受相同的手术准备和操作方式，以减少手术过程造成的误差。

1.4.2 脑室注射 大鼠经乙醚麻醉后固定于脑立体定位仪上，使颅骨保持水平位置，用过氧化氢灼烧暴露前囟点。然后用直径1.5 mm的钻头钻孔，位置为:前自后0.8 mm，旁开1.5 mm，深3.5 mm。利用微量注射器通过单侧脑室注射吡咯二硫氨基甲酸酯(100 mmol/L，4μl)。

1.4.3 各亚细胞组分的分离和蛋白样本制备 大鼠断头取脑，快速分离海马，并置于1∶10(W/V)的冰冷匀浆液(HEPES 50，pH 7.4，KCl 100，Na3VO41，NaF 50，PMSF 1 mmol/L)中，匀浆器高速破碎组织。4℃低温离心10 min取上清，为胞质和胞膜组分，沉淀为胞核。加匀浆液悬浮胞核沉淀，超声破碎，离心10 min，取上清为胞核成分。Bradford法测定蛋白含量并将组织样本调为等量蛋白浓度，置－80℃保存或直接100℃ ×5 min变性蛋白样本。

1.4.4 电泳与免疫印迹分析 采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，并转移至硝化纤维素膜(NC)。3%牛血清白蛋白(BSA)封闭2 h，室温下一抗孵育4 h，接着TBST洗膜，加入相应酶标二抗辣根过氧化物酶(HRP)结合羊抗兔或抗鼠IgG(1∶10 000)，室温反应2 h，洗膜后，滴加显色剂，暗室胶片曝光。

2 结果

2.1 脑缺血/再灌诱导海马脑区MMP-9蛋白水平变化 为了检测缺血/再灌大鼠海马脑区 MMP-9蛋白水平变化，采用MMP-9和抗体检测了MMP-9和β-actin蛋白含量变化。免疫印迹结果表明:前脑缺血再灌24 h，能诱导pro-MMP-9蛋白含量显著上调(P＜0.05)，为空白对照组的2.45倍，而β-actin蛋白水平基本保持稳定。提示前脑缺血诱导海马脑区MMP-9蛋白含量增加，其功能上调与缺血性脑损伤密切联系，见图1。

2.2 脑缺血/再灌海马脑区NF-κB核易位变化 为评价脑缺血后核转录因子NF-κB对MMP-9基因表达的潜在机制，采用差速离心结合免疫印迹技术观察了不同亚细胞组分NF-κB及β-actin蛋白水平变化。结果表明脑缺血再灌12 h能诱导NF-κB胞浆蛋白含量减少(5.88%，P＜0.05)，胞核蛋白显著增加(429.4%，P＜0.05)，而总蛋白水平基本保持不变(113.2%，P＞0.05)，同时β-actin总蛋白水平基本稳定。提示前脑缺血诱导NF-κB核易位增加和功能上调，可能参与了缺血后脑组织基因表达调节。见图2。

2.3 NF-κB信号通路对脑缺血后pro-MMP-9蛋白水平的调节为了证实NF-κB信号通路参与了MMP-9基因表达调控，采用脑室注射NF-κB抑制剂PDTC，抑制NF-κB信号通路。PDTC能有效下调缺血/再灌海马脑区MMP-9蛋白表达增加，与溶剂组比降低了17.5%，两者差异显著(P＜0.05)。提示缺血诱导的NF-κB激活参与了MMP-9基因表达调控，是其蛋白水平增加及功能上调的重要分子机制。见图3。

图1 免疫印迹检测脑缺血再灌海马组织pro-MMP-9蛋白含量变化

图2 W estern印迹结合亚细胞分离实验评价脑缺血再灌海马组织NF-κB蛋白水平变化

图3 免疫印迹结合药理学实验分析脑缺血再灌NF-κB抑制剂(PDTC)对pro-MMP-9蛋白水平的影响

2.4 白藜芦醇对脑缺血后NF-κB核易位和MMP-9表达的影响 为了阐明自由基清除对脑缺血NF-κB功能及MMP-9蛋白水平的影响，腹腔注射白藜芦醇。免疫印迹检测表明:白藜芦醇能显著性抑制缺血后NF-κB胞浆含量减少和MMP-9蛋白水平增加(80.39%，156.9%)，与溶剂组比有显著差异(23.53%，264.7%，P＜0.05)。提示脑缺血诱导NF-κB功能上调及其介导的MMP-9基因表达与自由基生成有密切联系，白藜芦醇通过抑制NF-κB通路，下调MMP-9胞外基质降解功能，减弱脑缺血后神经损伤。见图4。

图4 白藜芦醇对脑缺血后NF-κB核易位和MMP-9表达的影响

3 讨论

有研究表明〔3〕:白藜芦醇能清除超氧阴离子、NO、羟基自由基等，减少H2O2产生，显著抑制氧化性指标丙二醛(MDA)、乳酸(LD)含量增加，恢复超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱苷肽(GSH)水平，从而减少脑梗死和水肿体积，发挥氧自由基清除剂的保护功效〔4，5〕。也有学者认为白藜芦醇对脑缺血后的神经保护作用与其抗炎功效、雌激素活性、调节多种神经递质和神经调质的释放等有关〔6～11〕。本研究揭示，白藜芦醇能通过抑制NF-κB核易位，下调脑缺血MMP-9蛋白水平，阻断MMP-9介导的细胞外基质降解和血脑屏障损伤，继而发挥相关神经保护功能。

MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶。近年越来越多的证据表明:激活的MMP-9能降解血管周围基膜主要成分Ⅳ、Ⅴ型明胶胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白〔12〕，触发组织继发性损伤。MMP-9被确认能定位于脑内神经元、胶质细胞及血管内皮细胞。脑缺血后，MMP9含量增加，可降解细胞外基质成分，破坏神经细胞间的联系和血脑屏障〔13，14〕，继而导致炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞)侵入脑组织，诱导继发性炎症反应。同时血脑屏障的破坏也促进了毛细血管内水分和血浆蛋白的外渗，造成血管源性脑组织水肿〔15〕;两者共同触发脑组织广泛损伤，成为脑内神经功能丧失的重要诱因。

MMP-9的基因表达受多种因素调控，其中其基因启动序列－670～ －599，被识别是 NF-κB p65结合位点，能诱导 MMP-9基因转录起始〔12〕。肿瘤细胞侵袭实验发现:NF-κB的高度激活伴随MMP-9的高表达，是细胞外基质降解的重要调控机制〔16，17〕。本研究证实，脑缺血再灌能刺激 NF-κBp65 的核转位增加，且抑制NF-κB功能能显著抑制缺血后MMP-9蛋白水平。因而，作为核转录因子，NF-κBp65参与了脑缺血MMP-9基因表达调控，密切联系海马脑区组织损伤。

综上所述，白藜芦醇作为自由基清除剂，能通过抑制脑缺血诱导的NF-κB核转位，继而下调MMP-9基因表达和功能上调，阻止缺血后MMP-9对胞外基质的降解，稳定脑组织内环境，降低脑神经元损伤，发挥生物学保护功能。本研究阐明了脑缺血神经损伤的分子机制及白藜芦醇阻止神经损伤的新途径，能为临床治疗缺血性脑卒中提供有益的启示。

1 Wu D，Zheng H，Zhu ZJ，et al.Study on tumor cell dissemination during orthotopic liver transplantation for hepatocellular carcinoma and its correlation with MMP-9 and CD44v6〔J〕.Chin JModern Med，2008;18(11):1521-4.

2 Cao Q，Qian M，Wang XF，et al.Negative feedback regulation of Raf/MEK/ERK cascade in a ratmodel of cerebral ischemic preconditioning〔J〕.Neurochem Res，2011;36(1):153-62.

3 Sinha K，Chaudhary G，Gupta YK.Protective effect of resveratrol against oxidative stress inmiddle cerebral artery occlusionmodel of stroke in rats〔J〕.Life Sci，2002;71(6):655-65.

4 LiH，Yan ZY，Zhu J，etal.Neuroprotective effects of resveratrol on ischemic injurymediated by improving brain energymetabolism and alleviating oxidative stress in rats〔J〕.Neuropharmacology，2011;60(2-3):252-8.

5 Seema Y，Fahim A，Muzamil A，et al.Resveratrol exerts its neuroprotective effect by modulating mitochondrial dysfunctions and associated cell death during cerebral ischemia〔J〕.Brain Res，2009;1250:242-53.

6 Yang Yumin，Wang Xiaoling，Zhang Li.Inhibitory effects of resveratrol on platelet activation induced by thromboxane A(2)receptor agonist in human platelets〔J〕.Am JChin Med，2011;39(1):145-59.

7 Sun Albert Y，Wang Qun，Simonyi Agnes.Resveratrol as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases〔J〕.Mol Neurobiol，2010;41(2-3):375-83.

8 Mohd Moshahid Khan，Ajmal Ahmad，Tauheed Ishrat，et al.Resveratrol attenuates 6-hydroxydopamine-induced oxidative damage and dopamine depletion in ratmodelof Parkinson's disease〔J〕.Brain Res，2010;1328:139-51.

9 Jin A Shin，Hyunah Lee，Yoo-Kyoung Lim，et al.Therapeutic effects of resveratrol during acute periods following experimental ischemic stroke〔J〕.JNeuroimmunol，2010;227:93-100.

10 Saleh MC，Connell BJ，Saleh TM.Resveratrol preconditioning induces cellular stress proteins and asmediated via NMDA and estrogen receptors〔J〕.Neuroscience，2010;166:445-54.

11 Chao Li，Zhiying Yan，Jing Yang，et al.Neuroprotective effects of resveratrol on ischemic injurymediated bymodulating the release of neurotransmitter and neuromodulator in rats〔J〕.Neurochemi Int，2010;56:495-500.

12 Chandrasekar B，Mummidi S，Mahimainathan L，et al.Interleukin-18-induced human coronary artery smoothmuscle cellmigration is dependent on NF-kappaB-and AP-1-mediated matrix metalloproteinase-9 expression and is inhibited by atorvastatin〔J〕.JBiol Chem，2006;281(22):15099-109.

13 Power C，Henry S，Del Bigio MR，et al.Intracerebral hemorrhage induces macrophage activation and matrix metalloproteinases〔J〕.Ann Neurol，2003;53(6):731-42.

14 Wang C，Deng X，Li X，et al.Matrix metalloproteinase 9 expression is induced by Epstein-Barr virus LMPI via NF-κB or AP-1 sigaling pathway in nasopharyngeal carcinoma cells〔J〕.Chin J Oncol，2002;24(1):9-13.

15 Rosenberg GA，Navratil M.Metalloproteinase inhibition blocks edema in intracerebral hemorrhage in the rat〔J〕.Neurology，1997;48(4):921-6.

16 PizziM，Sarnico I，Lanzillotta A，et al.Post-ischemic brain damage:NF-kappaB dimer heterogeneity as a molecular determinant of neuron vulnerability〔J〕.FEBS J，2009;276(1):27-35.

17 Goebeler M，Gillitzer R，Kilian K，etal.Multiple signaling pathways regulate NF-KappaB dependent transcription of themonocyte chemoattractant protein1 gene in primary endothelial cell〔J〕.Blood，2001;97(1):46-55.

Effect of resveratrol on NF-κB-induced upregulation of MMP-9 function follow ing cerebral ischem ia

ZHU Jia-Lei，DENG Xia-Heng，GAO Li，et al.
Laboratory Center for Basic M edical Sciences，Nanjing M edical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China

ObjectiveTo explore themolecularmechanisms underlying inhibiting MMP-9 function increasing resulted from cerebral ischemia by resveratrol and its relationswith NF-κB signaling pathway.MethodsFour arterial forebrain ischemiamodel of ratswere established and the changes of MMP-9 protein and NF-κB nuclear transfer were observed by adopting immunoblot assay after ischemia reperfusion in hippocampus.ResultsAfter ischemia reperfusion was adopted，MMP-9 protein level in hippocampus and NF-κB nuclear transfer were induced to increase.PDTC inhibited the increasing of MMP-9 expression to a certain degree after ischemia reperfusion.Resveratrol significantly inhibited NF-κB nuclear transfer and MMP-9 expression after ischemia reperfusion.ConclusionsMMP-9 expression depends on NF-κB pathway is increased as induced by reperfusion after cerebral ischemia.Resveratrol can inhibit the function of MMP-9 through NF-κB pathway，therefore blocking the extracellularmatrix degradation and the damage to the hippocampus areawhich is resulted from the activation of MMP-9.

Cerebral ischemia;Resveratrol;MMP-9;NF-κB

R34

A

1005-9202(2013)05-1073-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.040

国家自然科学基金(81170714);南京市科技发展计划科研项目(200901081)

1 南京医科大学附属脑科医院

2 南京医科大学生物化学与分子生物学系

沈 伟(1971-)，男，副主任医师，博士，硕士生导师，主要从事退行性神经病变研究。

朱佳蕾(1989-)，女，在读本科，主要从事神经退行性疾病药理学研究。

〔2011-11-18收稿 2012-03-14修回〕

(编辑 曹梦园)