E－选择素基因多态性与脑梗死相关性研究

袁 冬，阚春燕，高 鹏，杜丹华，吴 江

E－选择素基因多态性与脑梗死相关性研究

袁 冬1，阚春燕1，高 鹏2，杜丹华1，吴 江1

目的 探讨E－选择素(E－selectin)及基因A561C多态性与脑梗死相关性。方法 以rs5361位点为遗传标记，采用聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)检测199例脑梗死组和124例对照组人群E－selectin基因的多态性。结果 脑梗死组与对照组的rs5361位点的等位基因和基因型频率在两组中比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);相对风险度分析，C等位基因携带者患脑梗死的风险是A等位基因的5.4倍。脑梗死组AC+CC基因型频率明显高于对照组(P=0.00)。结论 E－selectin基因A561C多态性与脑梗死的发病相关，C等位基因可能是脑梗死发生的危险因素之一。

E－选择素;脑梗死;基因多态性

脑梗死(cerebral infarction，CI)因其具有高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率的特点，已成为严重危害人类健康的重要疾病［1］。传统危险因素如吸烟、不良饮食习惯、血脂异常、高血压、糖尿病等与脑梗死的发生有关。而近年来的遗传学研究表明脑梗死的发生具有遗传易患性。动脉粥样硬化(AS)导致的脑梗死是最常见的类型，亦是脑血管疾病重要的病理基础，而内皮细胞损伤则是动脉粥样硬化的始动环节。E－选择素(E－selectin)是一种细胞粘附分子，可在损伤内皮细胞的表面高度表达，从而促进动脉粥样硬化斑块的形成［2］。因此，本研究选择选择素基因(EALM1)A561C作为动脉粥样硬化性脑梗死的候选基因，通过对该基因多态性的研究，探讨其与脑梗死之间的关系。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选取2011～2012年期间在吉林大学第一医院神经内科住院的199例脑梗死患者作为病例组，其中男143例，女56例，年龄29～83岁，平均60.1±10.7岁，经神经系统检查、TCD和颈动脉超声及头部CT或MRI检查，诊断为动脉粥样硬化性脑梗死，除外房颤、肿瘤等栓子来源的脑栓塞性疾病，除外肝肾功能不全、血液系统疾病。并尽量收集完整的临床资料，包括患者的一般情况(性别、年龄、民族、体重指数、腰围、烟酒嗜好)、既往病史、家族史、血脂、血糖、血尿常规、肾功能、心电图等。对照组来自吉林大学第一医院体检中心的健康体检者，共124例，其中男97例，女27例，年龄25～87岁，平均58.2±8.2岁。经病史询问无脑血管病史，部分经头部CT或MRI证实。入组对象签署知情同意书，并采集全血用于DNA提取。

1.2 实验方法 (1)标本采集:抽取患者、对照者空腹外周静脉血置于－20℃冰箱保存备用。(2)基因组DNA的提取:采用Wizard基因组DNA提取试剂盒(美国Promega公司)抽提基因组DNA。(3)基因组DNA浓度与纯度测定:用ND－1000紫外/可见光分光光度计(NanoDrop，美国)进行定量测定，调整模板DNA浓度在25－50ng/μl。(4)聚合酶链反应(PCR):基因引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，其核苷酸序列如下:上游引物:5’－TATGACACCATCTGCACCAG－3’，下游引物:5’－GCACAGTAATAGTCCTCCTC－3’。 反 应 体 系(20μl):DNA模板1μl、PCR引物2μl(上游引物、下游引物各1μl)、2×Taq DNA Starmix 10μl、ddH2O 7μl。PCR反应条件:预变性94℃ 2min，变性94℃30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 30s，共进行35个循环，最后延伸72℃5min。(5)PCR产物的检测:取PCR扩增产物2μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统(UVP，美国)下观察结果。(6)限制性核酸内切酶酶切:PCR扩增产物 15μl，PstI(MBI Fermentas)0.7μl，10×Buffer 2μl，BSA 0.2μl。37℃温育箱孵育10h。(7)电泳判断基因型:酶切产物加样在含花青素、浓度为2%的琼脂糖凝胶上电泳，电压为115V，电泳35min，经凝胶成像与分析系统观察电泳图。

1.3 统计学分析 应用拟和优度检验分析病例组和对照组基因型频率的分布是否符合Hardy－Weinberg(H－W)平衡;UNPHASED遗传学软件应用cocaphase对等位基因频率进行分析，SPSS 15.0软件应用卡方检验对基因型频率进行分析。P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 E－selectin基因型分析 EALM1基因rs5361位点PCR扩增产物片段大小为266bp，根据限制性内切酶PstI酶切片段的情况，基因型有3种，AA型(199bp，66bp 2条带)，AC型(266bp，199bp，66bp 3条带)，CC型(266bp 1条带)(见图1、图2)。

2.2 脑梗死组与对照组E－selectin基因型及等位基因频率比较 拟和优度检验表明病例组(χ2= 18.152，P=0.00)和对照组(χ2=17.887，P=0.00)的基因型分布均未偏离H－W平衡，说明该群体为随机婚配。E－selectin A561C基因型在两组的分布差异具有显著性(χ2=18.152，P＜0.05，95%CI:2.57～12.85)，AC+CC基因型患脑梗死的风险是AA基因型的5.75倍。cocaphase分析表明脑梗死组C等位基因频率(11.8%)明显高于正常对照组(2.4%)，差异有显著性(OR=5.4，χ2=17.887，P＜0.05，95%CI:2.47～11.8)(见表1)。

图1 EALM1基因A561C多态性2%琼脂糖凝胶电泳结果

表1 脑梗死组与对照组E－selectin A561C基因型及等位基因频率的分布

3 讨论

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是脑梗死最常见的病因。研究表明，AS可能是一种慢性炎症状态，且局部和全身炎症反应贯穿了从脂纹形成到斑块破裂的全过程。E－selectin作为体内的一种促炎细胞因子，与动脉粥样硬化的形成、高血压、血脂异常等脑梗死高危因素之间关系密切。E－selectin能够介导活化的内皮细胞与白细胞的起始粘附，继而介导白细胞活化，使白细胞在损伤区域滚动，引起一系列炎症反应，导致AS的形成［3］。因此，炎症反应在动脉粥样硬化的发生、发展及并发症的产生中起着重要作用［4］。

E－selectin即人类白细胞分化抗原CD62E，是选择素家族(SF)成员之一，也是唯一仅表达于活化的内皮细胞表面的粘附分子(Ams)［5］。分子遗传学的研究表明，EALM1位于1号染色体长臂，全长约13kb，由14个外显子和13个内含子组成，外显子大小22～189bp不等，内含子长度106～1300bp不等，相对分子质量为115kD，由589个氨基酸残基构成，是细胞表面的单链跨膜糖蛋白。通过对E－selectin进行研究，发现E－selectin基因存在着基因变异及基因多态性。

德国学者Wenze等l［6］在1994年发现E－selectin基因多态性只有在激活的内皮细胞中表达，并证实EALM1第4外显子存在A561C基因多态性，认为它可能影响E－selectin的生物活性及相关疾病的发生、发展和转归。

韦叶生等［7，8］对广西壮族人群血清中EALM1 A561C基因多态性进行分析，研究发现 EALM1 A561C多态性与脑梗死的发病具有相关性，C等位基因可能是广西地区壮族人群脑梗死发病的遗传易感基因。同样采用PCR分子生物学技术检测将脑梗死患者与正常人E－selectin基因型作比较，结果发现脑梗死患者E－selectin基因A561C多态性分布与正常人比较，差异具有显著性(P＜0.05)，脑梗死患者E－selectin血清水平显著高于对照者，与国外文献［9］报道一致。为进一步研究E－selectin基因多态性与脑梗死的相关性，我们采用PCR－RFLP技术检测了199例脑梗死患者和124例正常人E－selectin基因型，结果发现脑梗死患者EALM1 A561C多态性分布与正常人比较差异具有显著性(P＜0.05)，其中携带AC+CC基因型个体患脑梗死的风险约是AA基因型的5.75倍，提示C等位基因可能是脑梗死的遗传易感基因，携带C等位基因的个体可促进E－selectin的高度表达进而增加罹患脑梗死的风险，这与韦叶生等［7］报道相一致。

综上所述，脑梗死是一种多基因遗传和多环境因素共同作用的复杂疾病，环境因素虽然可使其发病率增高，但遗传因素在脑梗死发病机制中的地位仍不容忽视。E－selectin作为体内的一种不可缺少的细胞粘附因子，具有表达的瞬时性及特异性［10］，它的功能日益受到重视。目前，关于脑梗死相关基因的研究还处在初级阶段，还有待进行大规模、多地域、多民族的系统研究，相信随着对E－selectin研究的深入，必将给脑梗死的治疗开辟更为广阔的未来。

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Association study between a polymorphism of E-selectin gene and cerebral infarction

YUAN Dong，KAN Chunyan，GAO Peng，et al.(Department of Neurology，The First Hospital of Jilin University，Changchun130021，China)

ObjectiveTo detect the E－selectin and A561C gene polymorphism in patients with cerebral infarction. Methods Genotypes of E－selectin in 199 patients with cerebral infarction and 124 controls were typed by PCR－RFIP，SNPrs5361.ResultsThere was significant difference in frequencies of allele and genotype in E－selectin A561C polymorphism between patients group and control group(P＜0.05).Relative risk analysis indicated that the risk of cerebral infarction in C allele was 5.4 times higher than that in A allele.And the frequency of AC+CC genotypes in patients group was significant higher than control group(P=0.00).ConclusionE－selectin A561C polymorphism was associated with cerebral infarction，and C allele might be a risk factor of cerebral infarction.

E－selectin;Ccerebral infarction;Genes polymorphism

R743.3

A

1003－2754(2013)03－0208－03

2013－01－06;

2013－02－28

卫生部临床重点项目

(1.吉林大学白求恩第一医院神经内科，吉林 长春130021;2.吉林大学白求恩第一医院内分泌科，吉林长春130021)

吴 江，E－mail:sjnkwujiang@sina.com