腺病毒介导的rHSG对大鼠迟发性脑血管痉挛作用的实验研究

王保江，罗 卫，沈 冰

腺病毒介导的rHSG对大鼠迟发性脑血管痉挛作用的实验研究

王保江1，罗 卫2，沈 冰3

目的 探讨重组腺病毒介导的大鼠增殖抑制基因(rHSG)对大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后基底动脉(BA)迟发型脑血管痉挛(DCV)的影响。方法 SD大鼠156只随机分为5组:SAH组(A组，36只)、SAH+AdvrHSG－GFP组(B组，36只)、SAH+Adv－GFP组(C组，36只)、假手术组(D组，36只)和正常对照组(E组，12只)。采用枕大池二次注血法建立大鼠SAH模型，假手术组注射等量生理盐水。将重组腺病毒Adv－rHSG－GFP及空载腺病毒Adv－GFP分别转染B、C组大鼠BA。设立4d、7d、10d 3个观测点，HE染色后测量BA内径周长及血管壁厚度，观察血管结构改变;免疫组化染色后检测BA中rHSG蛋白表达;用RT－PCR法检测BA中rHSG mRNA表达。结果A﹑C组各时相BA有不同程度的内膜增厚皱折、平滑肌层增厚等增殖性改变。与A组及C组相比，B组7d、10d时BA血管痉挛明显缓解，且rHSG蛋白及mRNA表达明显增强(P＜0.01)。结论 rHSG的过表达可以减轻SAH后血管壁的增殖和DCV，为外源性rHSG基因治疗DCV提供了实验依据。

大鼠; 蛛网膜下腔出血; 迟发性脑血管痉挛; 大鼠增殖抑制基因; 增殖细胞核抗原

脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)呈双相性，一种为早发性，多见于蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)后0.5h～3d内，常于4h内缓解，也称急性CVS;另一种发生于SAH后4d～15d，7d～10d为高峰期，2～4w逐渐缓解，称为迟发性脑血管痉挛(delayed cerebral vasospasm，DCV)。DCV对血管扩张剂的反应性较差，难于逆转，是迟发性脑缺血最常见的原因，可使SAH后前2w的死亡率增加1.5～2倍［1］。SAH后DCV的发生究竟是脑血管平滑肌持续主动收缩的结果，还是脑血管壁结构破坏、血管平滑肌细胞增殖导致的器质性管腔狭窄所致尚无定论。预防和治疗DCV已是治疗SAH患者的主要目标，也是目前研究的热点。大鼠增殖抑制基因1(rat hyperplasia suppressor gene－1，rHSG)是近年发现的一种新的与细胞增殖相关的信息传递分子，它对血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用［2］。前期研究表明，SAH后DCV的发生和严重程度与血管壁增殖程度及大鼠增殖抑制基因1(rat hyperplasia suppressor gene－1，rHSG)低表达密切相关［3～5］。本实验运用腺病毒载体在大鼠体内过表达rHSG，观察rHSG对大鼠SAH后基底动脉(basilar arteries，BA)血管壁增殖和DCV的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 HSG/MFN2多克隆抗体购自SANTA公司;小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen，PCNA)单克隆抗体购自武汉博士德;SP免疫组织化学试剂盒购自北京博奥森公司; DAB显色试剂盒购自北京天根生化科技公司;rHSG和β－actin上下游引物由上海生工生物合成;SV Total RNA Isolation System及Access RT－PCR Introductory System均购自Promega公司。

1.2 重组腺病毒载体的构建 含有rHSG编码序列的重组腺病毒载体Adv－rHSG－GFP和含有绿色荧光蛋白基因的对照载体Adv－GFP由本研究组构建，并经测序鉴定。以293细胞扩增腺病毒，氯化铯密度梯度离心以纯化病毒［6，7］。

1.3 实验动物及分组 Sprague－Dawley大鼠156只，由宁夏医科大学实验动物中心提供，雌雄不拘，体重320g±80g，随机分为4组:SAH组(A组，36只)、SAH+Adv－rHSG－GFP组(B组，36只)、SAH +Adv－GFP组(C组，36只)、假手术组(D组，36只)和正常对照组(E组，12只)。A组采用枕大池二次注血法诱发制成SAH，B、C组手术方法同上，注血同时混合50μl滴度为2.5×109pfu/ml的AdvrHSG－GFP或Adv－GFP病毒悬液，注入枕大池，D组仅注射等量生理盐水。各组分别于首次注血(或生理盐水)后4d、7d、10d各处死12只，6只用于形态学检测，6只用于rHSG mRNA检测。E组不做任何处理。

1.4 DCV模型的制作 大鼠用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，暴露环枕膜，A组抽取自体股动脉血0.3ml，以0.lml/min的速度缓慢注入枕大池，俯卧位头低30度约30min，使血液进入基底池，48h后二次注血。B、C组手术方法同上，以等量自体血混合50μL滴度为2.5×109pfu/ml的 Adv－rHSG－GFP或Adv－GFP病毒悬液，注入枕大池。

1.5 标本获取 A、B、C组分别在首次注血(和/或病毒悬液)后4d、7d、10d各处死12只大鼠。形态学检测标本采用断头法处死，获得完整BA的脑干，先截取1/3长度的BA冷冻切片后在倒置荧光显微镜下观察GFP表达，剩余标本置于10%福尔马林液内固定，石蜡包埋、切片、HE染色;采用SP法分别行PCNA和rHSG免疫组织化学染色。RTPCR检测标本采用快速断头取脑，取完整BA，剔除蛛网膜组织，用无菌生理盐水冲洗后迅速置－86℃冰箱保存。

1.6 光镜下BA形态学检查 BA横断面石蜡切片行HE染色，Motic BA400生物显微镜400倍下拍照，参照文献方法［8］用Motic ImagesPlus 2.0计算机图像分析系统计算BA血管内径周长及血管壁厚度，并观察血管结构变化。

1.7 rHSG基因转染BA血管壁细胞及其表达

1.7.1 倒置荧光显微镜观察GFP表达 大鼠BA组织冰冻切片，层厚10μM，空气中烘干30min，直接在倒置相差显微镜下观察血管壁中GFP表达所产生的绿色荧光，以确定转染是否成功。

1.7.2 免疫组织化学染色及计算机图像分析采用SP法，PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性片作阳性对照，DAB显色，镜下控制反应时间，苏木素复染。以胞核或胞浆出现棕黄色或棕褐色为阳性信号。PCNA及rHSG蛋白染色标本在高倍镜(× 400)下照相，按照参考文献［9，10］的方法，将图片导入Image－Pro Plus 6.0图像分析系统，计算每张切片阳性区域的平均光密度(Mean density)和积分光密度(integrated optical density，IOD)。

1.7.3 RT－PCR检测rHSG mRNA表达 BA总RNA提取及一步法逆转录均按Promega公司说明书进行。1μg总RNA在总体积50μL中进行cDNA合成及PCR扩增，rHSG上游引物序列为:5’－GGA GCT GGA CAG CTG GAT TGA T－3’，下游引物序列为:5’－AGC TCC AGC TGC TTG TCC ATG A－3’，扩增片断长度609bp［2，11］;同时以扩增片断长度278bp的β－actin作为内参照，β－actin上游引物序列为:5’－CGT AAA GAC CTC TAT GCC AA－3’，下游引物序列为:5’－GCT CAG TAA CAG TCC GCC TA－3’。RT－PCR反应条件为:48℃45min，94℃2min，1个循环;94℃30s，61℃45s，72℃80s，35个循环;72℃最终延伸7min后终止反应。产物经1.5%琼脂糖凝胶水平电泳，EB染色，凝胶成像仪照相，Quantity one

4.3.1凝胶分析系统对各电泳条带的亮度和面积进行分析，最后得出各条带总信号量(adjust Volume)，结果以rHSG/β－actin的比值表示。

2 结果

2.1 动物存活情况 D组大鼠均存活，A组、B组和 C组大鼠死亡率分别为 21.4%、15.5%、23.1%;A组和C组大鼠大多于二次注血后7d内死亡，术后存活时间超过1w时死亡率明显下降;B组大鼠多于首次注血后3d内死亡。

2.2 GFP在BA血管的表达 荧光显微镜下各组大鼠BA内膜均见微弱自主荧光，不同时间点强度不变;B组和C组所有大鼠基因转染均成功，枕大池注入Adv－rHSG－GFP和Adv－GFP后4d，BA外膜层可见较强烈的绿色荧光，血管中层可见中等强度绿色荧光;至7d时，血管外膜及中层绿色荧光均明显减弱;10d时，血管外膜及中层已观察不到绿色荧光。

2.3 光镜下BA的大体形态学改变及内径周长、血管壁厚度的时相变化 A组及C组不同时相BA血管均发生血管内径明显变小、管壁增厚、内弹力纤维皱缩并向血管腔内隆起等形态学改变，和D组相比较有明显差异(P＜0.01)，提示DCV造模成功。B组各时相BA血管虽有轻微DCV表现，但和A、C组相响应时间点比较，已明显减轻(P＜0.01)。正常对照组及假手术组大鼠BA血管结构正常，管腔圆滑，平滑肌细胞排列整齐，弹力明显(见表1)。

2.4 SAH后大鼠BA中PCNA和rHSG蛋白的表达 A组及C组各时间点BA血管壁均可见PCNA表达，以7d最为显著(P＜0.01)，B组各时相BA血管壁亦可见PCNA表达，但和A、C组响应时间相应时间点比较明显降低，又以7d降低最为明显(P＜0.01)。rHSG蛋白染色部位在胞浆，A、C组大鼠BA血管壁在首次术后均可见rHSG表达下降，B组rHSG表达在4d即有增加，7d时最强(P＜0.05) (见图1)，到10d时恢复至4d时水平(见表2、表3)。

图1 大鼠基底动脉免疫组化染色光镜显微照片(DAB显色，×200)

表1 大鼠基底动脉内径周长及基底动脉壁厚(n=6，μm，±s)

表1 大鼠基底动脉内径周长及基底动脉壁厚(n=6，μm，±s)

与A、C组各时间点分别比较▲P＜0.01;与各组内其他时间点及正常组比较▽P＜0.01;与A、C组相应时间点比较★P＜0.01

组别BA 壁厚BA 内径周长4d 7d 10d 4d 7d 10d A组B组C组D组E组16.09±0.20 15.82±0.20 15.9±0.1 13.77±2.80▲14.00±2.00▲25.90±0.36▽15.08±0.10★24.80±0.40▽14.05±2.07▲23.59±0.60 17.35±0.20★21.01±0.70 13.89±1.47▲596.00±12.00 599.00±8.00 604.00±21.00 615.30±5.78▲612.88±7.15▲511.00±14.00▽605.00±11.00★501.00±19.00▽613.87±7.42▲547.00±12.00 597.00±8.00★562±10.46 614.10±6.07▲

表2 PCNA和rHSG的表达(±s，n=6)

表2 PCNA和rHSG的表达(±s，n=6)

与A、C组对应时间点比较▽P＜0.01;与各组内其他时间点比较★P＜0.01

组别平均光密度积分光密度4d 7d 10d 4d 7d 10d A组B组C组D组E组0.212±0.044 0.185±0.044▽0.235±0.030 0 0 0.310±0.026★0.246±0.026▽★0.290±0.015★0 0.300±0.029 0.253±0.029▽0.285±0.020 0 14.862±1.820 11.352±1.820▽14.052±1.250 0 0 22.493±2.543★17.420±2.543▽★21.950±1.980★0 19.927±1.995 14.356±1.085▽19.050±1.742 0

表3 rHSG的表达(±s，n=6)

表3 rHSG的表达(±s，n=6)

与A、C组对应时间点比较▽P＜0.01;与各组内其他时间点比较★P＜0.01

组别平均光密度积分光密度4d 7d 10d 4d 7d 10d A组B组C组D组E组0.24±0.02 0.27±0.04▽0.24±0.03 0.25±0.03 0.25±0.04 0.18±0.01★0.38±0.03▽★0.18±0.10★0.26±0.01 0.21±0.02 0.32±0.03▽0.21±0.01 0.24±0.09 10.81±0.90 12.58±1.30▽10.19±1.20 11.95±0.37 11.70±0.40 8.07±0.70★20.70±1.00▽★7.95±0.80★12.09±0.41 8.45±0.50 13.49±1.60▽8.70±0.50 12.41±0.69

表4 BA基底动脉中rHSG/β－actin的相对表达量(±s，n=6)

表4 BA基底动脉中rHSG/β－actin的相对表达量(±s，n=6)

与D组及A、C组相应时间点比较▲P＜0.01

组别adjust Volume(rHSG/β－actin) 4d 7d 10d A组B组C组D组E组0.2744±0.231 0.2841±0.057 0.2731±0.005 0.290±0.010 0.283±0.017 0.2394±0.017 0.3667±0.013▲0.232±0.013 0.289±0.013 0.2849±0.06 0.3094±0.016▲0.2863±0.013 0.291±0.020

2.5 大鼠BA血管壁rHSG mRNA的表达 A、C组大鼠BA rHSG mRNA表达在首次术后均明显下降，B组rHSGmRNA表达在各时相均与不同程度增加，以7d时最为明显(P＜0.05)(见图2、表4)。

图2 4组大鼠BA血管壁rHSG mRNA表达

3 讨论

DCV是十分复杂的病理生理学过程，探索新的预防及治疗方法对于降低SAH患者的死亡率、残疾率具有重大的意义。过去研究表明DCV是多种因素如氧合血红蛋白(oxyHb)、内皮素－1(ET－1)、PKc激酶、免疫炎症反应以及补体复合物成分等综合作用的结果［12，13］，但不能做出较为满意的解释。近年来，一些学者认为SAH后DCV的发生是血管壁结构改变的结果，其中血管平滑肌细胞增殖尤为重要［14～16］。

rHSG被证实有抑制血管细胞的增殖、迁移和重塑的作用［2］。前期实验证明，大鼠SAH后4～16d，BA血管壁rHSGmRNA相对表达量降低，以SAH后7d最为明显，提示rHSG和SAH后DCV有密切关系［2，3］。本实验用重组腺病毒Adv－rHSG－GFP转染SAH大鼠BA，旨在探讨外源性rHSG对SAH后DCV的影响。结果显示，外源性rHSG在大鼠SAH后第7d表达量最高，在SAH后第10d下降至第4d水平，明显减轻了DCV的程度，表明外源性rHSG在BA中表达持久，采用基因治疗有足够的时间窗，为临床预防和治疗SAH后DCV提供了实验依据。

因实验设计需求，未能检测SAH后前3d及及其它时间点rHSG的表达情况，故外源性rHSG表达峰值开始及持续时间尚需进一步验证。

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Adenovirus-mediated gene transfer of rHSG-1 inhibits proliferation of vascular smooth muscle cells from delayed cerebral vasospasm rats

WANG Bao－jiang，LUO Wei，SHEN Bing.(Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China)

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant adenovirus mediating rats hyperplasia suppresion gene(rHSG)on delayed cerebral vasospasm(DCV)after experimental subarachnoid hemorrhage(SAH)in rats.Method156 Sprague－Dawley rats were randomly divided into SAH group(A，n=36)，SAH+Adv－rHSG－GFP group(B，n= 36)，SAH+Adv－GFP group(C，n=36)，sham operation group(D，n=36)and normal control group(E，n=12).SAH were developed with two times injections of arterial blood into cisterna magna，and 0.3ml normal saline(NS)injected for sham operation group.For group B and group C，Adv－rHSG－GFP and Adv－GFP were transfected into the basilar arteries(BA)of rats.The BAs were harvested at day4，7，10 after experiments.BA were stained by hematoxylin－eosin for measurements of perimeter，wall thickness and observation of structures respectively.Proteins of rHSG in BA was evaluated by immunohistochemically stainnedstry.Expression changes of rHSG mRNA in the BA were identified by RT－PCR.ResultsFor A and C group，DCV appeared at the day4 after the first cisterna magna injection and reached the peak in the day7 and continued maintained untill the day 10.The DCV wasere significantly reduced，and the expression of rHSG protein and mRNA increased at day 4，10 of in B group compared with A group and C group(P＜0.01).ConclusionThe over expression of the rHSG can reduce the proliferation of the vascular wall after SAH and DCV，this study provided experimental evidence for treatment of DCV with exogenous rHSG.

Rats;Subarachnoid hemorrhage;Delayed cerebral vasospasm;rHSG;PCNA

R743.35

A

1003－2754(2013)03－0196－05

2012－11－28;

2013－01－20

宁夏自然科学基金资助项目(NZ10136)

(1.宁夏医科大学，宁夏银川750004;2.陕西中医学院附属医院神经外科，陕西西安712000;3.宁夏医科大学附属医院神经外科，宁夏银川750004;王保江，硕士研究生，现在宝鸡市解放军第三医院神经外科研究所，陕西宝鸡721000)

沈 冰，E－mail:shenbing315@sina.com.cn