Aβ25-35寡聚体对大鼠海马神经细胞的活性影响及形态学观察

黄昕艳， 赵锦程， 尉荣翠， 杨 智， 刘 爽， 朱晓峰

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种慢性进行性神经退变性病变，其典型的临床病理学改变为β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积、神经元纤维缠结和神经元缺失［1］。Aβ是老年斑的核心成分，在AD的发生、发展过程中起关键作用，本实验旨在通过Aβ25-35寡聚体诱导海马神经元细胞损伤来探讨其活性及形态学指标的变化，筛选Aβ25-35寡聚体致伤条件下适宜的AD细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物:新生 Wistar大鼠(1～3d)，由佳木斯大学实验动物中心提供。(2)主要试剂:DMEM/F12干粉培养基、B27、Neurobasal-A培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(购于美国Gibco公司);Aβ25-35、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、HFIP(六氟丙醇)购于武汉博士德公司;兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)单克隆抗体、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒(购于Boster公司);青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代海马神经元培养 出生1～3d内的Wistar大鼠，无菌条件下断头，在冰浴的D-hank s液中取脑并分离出双侧海马组织，剪切成约1mm×1mm×1mm的组织块，0.125%胰酶37℃消化约20min。用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中终止消化，用口径光滑的小吸管反复吹打分散，200目细胞筛过滤后，1000r/min，离心5min，弃掉上清液，加入培养基重悬，制成(2～3)×105个/ml密度的细胞悬液，接种于预先用0.1mg/ml多聚赖氨酸包被的96、24、6孔板中。置于37℃、5%CO2培养箱内培养，24h后换成Neurobasl+B27(2%)培养基，以后每3d换液1次。

1.2.2 神经元鉴定 培养至7d的神经细胞，以PBS轻洗3遍，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗2次。0.4%TritonX-100破膜 20min，PBS洗 3遍，山羊血清封闭30min，滴加NSE(1∶200稀释)一抗，4℃湿盒内孵育过夜。次日PBS洗3遍，加二抗室温避光孵育50min，PBS洗3遍;加新鲜配制的DAB溶液显色，待显色充分后，加入三蒸水终止反应，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察，(PBS代替一抗做阴性对照)。

1.2.3 实验分组 将原代培养8d后的神经元随机分为5组:正常对照组、损伤组，加入终浓度分别为 1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L 的 Aβ25-35寡聚体，Aβ25-35寡聚体的制备参考王建秀等文献［2］，继续培养24h。

1.2.4 神经细胞形态学观察和定量分析Aβ25-35寡聚体孵育24h后，于倒置显微镜下观察其存活情况和形态，随机选取30个视野，记录每个视野内有突起的细胞数和突起总数，同时目镜微尺测量突起的长度，重复3次。

1.2.5 MTT法检测细胞活性 采用MTT比色法检测培养细胞的存活率。按上述分组处理24h后，向96孔板中各组细胞分别加入 5mg/ml MTT20μl，37℃继续培养4h后弃上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，待紫色结晶完全溶解后，用酶标仪检测各组细胞570nm吸光度值(opti-cal density，OD)。每个浓度设5个复孔，计算其平均值，同时设不加细胞的空白孔。根据公式计算:细胞存活率(%)=处理组细胞OD值/对照组细胞OD值×100%。

2 结果

2.1 神经元形态学观察及鉴定 接种后的海马神经细胞呈圆形，单个均匀分布，2h后开始贴壁，培养24h后细胞大部贴壁且部分已长出突起。随培养时间延长，突起逐渐增多、延长并交织成网。胞体呈多角形或椭圆形，周围有光晕，胞体体积较大，透光性强，核大;培养至7d的细胞胞体饱满、有立体感;突起明显增多、增长、交织成网、细胞生长成熟。与阴性对照、阳性对照比较，NSE免疫染色显示95%以上的培养细胞为阳性染色，符合细胞原代培养纯度要求(见图1)。

图1 神经细胞原代培养(×100)

Aβ致伤模型组可见到部分神经细胞出现胞体缩小，细胞周围晕光不强;细胞突起消失或明显减少、缩短，细胞碎片增多，甚至细胞崩解，神经细胞数目下降等变化。Aβ1.0μmol/L组神经细胞形态基本正常，贴壁良好、突起较长，可相互连接成网络。Aβ5.0μmol/L组神经细胞生长状态不如正常对照组旺盛，神经元突起数目、长度与正常对照组相比有明显的差异(P ＜0.05，P ＜0.01)。Aβ10.0μmol/L组神经细胞存活状态欠佳，突起变短，有较多的圆形及浮细胞，其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与正常对照组相比有显著的差异(P＜0.05，P＜0.01，P ＜ 0.01)。Aβ20.0μmol/L 组神经细胞生长较差，多数细胞突起变短、消失，细胞碎片较多。其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与正常对照组相比有显著的差异(P ＜0.01，P ＜0.01，P ＜0.01)，见图2、表1。

2.2 Aβ25-35寡聚体诱导损伤后神经细胞存活的影响 MTT测定结果显示，Aβ25-35寡聚体可导致神经细胞抑制，且神经细胞抑制表现为与Aβ寡聚体浓度依赖性关系，即随着Aβ寡聚体浓度增加神经细胞，存活率逐渐下降，其中20μmol/L组最明显，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05);Aβ25-35寡聚体毒性会导致细胞损伤(见图2)。

图2 Aβ不同致伤浓度对原代培养神经细胞的影响(倒置显微镜，×100)

表1 Aβ25-35对神经细胞形态学改变的影响(χ ± s，n=30)

表2 不同浓度Aβ肽对海马神经元的影响(±s)

表2 不同浓度Aβ肽对海马神经元的影响(±s)

与空白对照组比较*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别Aβ肽浓度(μmol/L)MTT吸光度(n=6)存活率(%)正常组模型组 1.0 5.0 10.0 20.0 1.23 ±0.05 1.19 ±0.04 0.96 ±0.06 0.87 ±0.05*0.62 ±0.03＊＊98.24 ±2.17 89.86 ±3.23 75.95 ±2.05 58.86 ±3.11

3 讨论

Aβ级联学说的提出源自对AD的神经病理特征的发现，已经确认老年斑的主要构成物质是β淀粉样物质，Aβ在脑内异常聚集引起神经毒性，包括直接毒性和增强、放大各种伤害性毒性，导致神经细胞死亡［3］。

目前认为，Aβ在大脑皮质内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件［4］，研究表明，Aβ在形成纤维性沉积前的中间体状态，即Aβ寡聚体亦可产生神经毒性作用。动物实验研究表明，Aβ寡聚体可以在生理水平明显抑制大鼠海马的突触传递［5］。且发现在AD发病早期还未出现明显的老年斑之前，其认知功能的减退与可溶性Aβ水平及突触功能障碍密切相关［6，7］。因此，建立良好而稳定的AD突触损伤模型对探索AD早期记忆损害事件的成因及AD发病机制的研究非常重要。

Aβ肽全长的第25～35个氨基酸残基是Aβ的非生理性最小毒性片段，故本实验以Aβ25-35寡聚体致伤与记忆密切相关的海马神经元为研究对象，来筛选适宜的AD突触损伤模型，为AD早期的防治探求的有效的途径。

Aβ25-35寡聚体致伤 24h后从形态学观察，Aβ25-35寡聚体可致神经细胞损伤，且神经细胞毒性表现与 Aβ25-35寡聚体呈剂量依赖性关系，其中Aβ25-3520μmol/L组致伤显著，细胞存活状态差，有部分细胞脱壁，细胞间网络消失，细胞外基质杂乱，其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与正常对照组相比有显著的差异(P＜0.01);不适宜作为AD突触损伤模型进行下一步研究。

Aβ25-3510μmol/L组突起的细胞数、神经元突起数目与Aβ25-3520μmol/L组相比有所改善，突起的细胞数与正常对照组相比有一定差异(P＜0.05)，但神经元突起数及突起的长度与正常对照组相比仍有显著的差异(P＜0.01)，大部分神经细胞突起已丧失，故也不宜作为适宜的突触损伤模型。

Aβ25-355μmol/L组细胞生存状态尚可，突起的细胞数与正常对照组比照差异不显著，神经元突起数目与正常对照组相比(P＜0.05)，突起的长度与正常对照组相比有显著的差异(P＜0.01)，损伤模型中神经细胞数量尚稳定，神经元突起数目有部分损失，但尚可作为Aβ致突触损伤模型做进一步研究。

对于Aβ25-351μmol/L组细胞损伤效果不明显，神经元突起数、突起长度与正常对照组比较差异不显著，不宜作为有效的突触损伤模型。

在MTT测定结果显示 Aβ25-3510μmol/L组与Aβ25-3520μmol/L组细胞存活率降低较明显，不适宜作为AD的突触损伤模型，同样支持上述结果。

本实验以Aβ25-35寡聚体致伤海马神经细胞，筛选出5μmol/L为适宜的AD突触损伤模型的致伤浓度，希望为AD早期的防治探索更有效的途径。

［1］Pereira C，Ferreiro E，Cardoso SM，etal.Cell degeneration induced by amyloid-beta peptides:implications for Alzheimer’s disease［J］.Mol Neurosci，2004，23(1):97-104.

［2］王建秀，王德生，段淑荣.Aβ25-35对PC12细胞损伤作用的研究［J］.中风与神经疾病杂志，2007，24(2):148.

［3］Lambert JC，Amouyel P.Genetics of Alzheimer’s disease:new evidences for an old hypothesis［J］.Curr Opin Genet Dev，2011，21(3):295-301.

［4］Wang HW，Pasternak JF，Kuo H，etal.Soluble oligomers of beta amyloid(1-42)inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus［J］.Brain Res，2002，924:133-140.

［5］Lacor PN，Buniel MC，Chang L，etal.Synaptic targeting by Alzheimer’s-related amyloid beta oligomers［J］.J Neurosci，2004，24:10191-10200.

［6］Tannenberg RK，Scott HL，Tannenberg AE，etal.Selective loss of synaptic proteins in Alzheimer’s disease:evidence for an increased severity with APOE varepsilon4［J］.Neurochem Int，2006，49(7):631-639.

［7］Spencer B，Rockenstein E，Crews L，etal.Novel strategies for Alzheimer’s disease treatment［J］.Expert Opin Biol Ther，2007，7(12):1853-1867.