丹参酮IIA对脑缺血再灌注损伤大鼠磷酸化p38MAPK和MMP-9表达及细胞凋亡的影响

李 浩， 张多斌， 吴 岚， 冯华坤

研究表明，脑缺血再灌注损伤发生后，细胞内p38 MAPK信号通路激活，参与了脑缺血神经元死亡过程的调控［1］。脑组织中基质金属蛋白酶9(matrixme talloproteinase，MMP-9)与缺血后血脑屏障损伤密切相关［2］。丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，TanⅡA)为丹参酮中含量最高的活性成分，我们前期研究发现，TanⅡA对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制与抑制炎症和凋亡基因蛋白表达有关［3～7］，但是否对神经细胞凋亡和血脑屏障有影响?本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究TanⅡA对大鼠脑缺血再灌注损伤磷酸化p38MAPK和MMP-9表达的影响及对细胞凋亡的作用，进一步探讨其保护作用的可能分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 雄性SD大鼠，清洁级，质量300±20g，桂林医学院SPF级动物实验中心提供。随机分成Sham组、IR组、TanⅡA高、低剂量治疗组，每组15只。

1.1.2 药品和试剂 TanⅡA(陕西昂盛生物医药科技有限公司提供，纯度98%);2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(Sigma公司);兔抗MMP-9抗体，兔抗p38多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒、T UNEL试剂盒和DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 给药途径与药量 TanⅡA低剂量治疗组(15mg/kg)和高剂量治疗组(30mg/kg)均于术前连续灌胃给药3d，每天1次;假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。3d给药后1h建立局灶性脑缺血120min再灌注24h动物模型。

1.2.2 动物模型的建立及评分 参照Longa等［8］的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞，线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27mm，插入深度约18mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分:按照Longa等［8］评分标准，各组分别在再灌注24h进行评分。0分:正常，无神经学征象;1分:动物不能完全神展右前肢;2分:动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象;3分:动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚;4分:无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在1～3分为模型成功。0分和4分为模型不成功予剔除，在后续实验中补充剔除出组的动物，保证每组动物数。

1.2.3 免疫组化检测 缺血再灌注后24h，各组随机取5只大鼠，生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11mm之间冠状切取约5mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚5μm。用SABC法进行磷酸化p38MAPK和MMP-9蛋白的免疫组织化学染色;阴性对照片用PBS液代替一抗。磷酸化p38MAPK阳性反应为细胞浆呈现棕黄色粒状或点状免疫标记，MMP-9阳性反应为细胞浆棕黄色淡染。于每个鼠脑分别取磷酸化p38MAPK和MMP-9切片，每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复高倍镜视野(×400)，计数每个视野阳性细胞数，算出平均数即为每张切片阳性细胞数。

1.2.4 细胞凋亡的检测 再灌注24h，各组随机取5只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11mm之间冠状切取约5mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚5μm。连取5张，1张作HE染色，其余4张作细胞凋亡。采用TUNEL法检测细胞凋亡，具体操作按试剂盒说明书进行。以胞核出现棕黄染色颗粒代表 TUNEL阳性细胞数。每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复高倍镜视野(×400)，计数每个视野阳性细胞数，算出平均数即为每张切片阳性细胞数。计数T UNEL阳性细胞数和细胞总数，以 T UNEL阳性率表示细胞凋亡。

1.2.5 血脑屏障通透性检测 参照 Matsuo等［9］的方法，采用EB染料检测BBB通透性。再灌注24h，各组随机取5只大鼠，经股静脉注射2%EB生理盐水3ml/kg。2h后，大鼠麻醉，由左心室用生理盐水灌流至右心耳流出清亮液体，然后断头取脑，称湿质量后置入装有0.5ml1mo l/L KOH溶液的离心管中，37℃ 过夜，然后加入/丙酮。离心15min，重复3次取上清液，用751型分光光度计在波长620nm处测定吸光度值。根据EB液的标准曲线，计算脑组织中的EB水平。

1.2.6 统计学处理 数据处理采用SPSS11.9统计软件进行运算，结果以±s表示，组间差异显著性检验采用方差分析。

2 结 果

2.1 TanⅡA A对磷酸化p38MPAK表达的影响 见表1。Sham组在缺血侧脑组织切片可见少量磷酸化p38表达，免疫反应产物颗粒分布弥散，胞浆、突触内少量存在(见图1)。与Sham组比较，IR组磷酸化p38表达增多，部位主要分布于缺血周边区的额顶皮质，差异有统计学意义(P＜0.05)(见图2)。与IR组比较，anⅡA高、低剂量治疗组磷酸化p38表达明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均＜0.05)(见图3、图4)。

2.2 TanⅡA对MMP-9活性的影响 见表1。再灌注24h，Sham组的脑组织皮质有少量MMP-9阳性表达细胞(见图5)。与 Sham组比较，IR组的MMP-9阳性表达细胞数目明显增加(见图6)，差异有统计学意义(P＜0.05)(P＜0.05)。与 IR组比较，TanⅡA高、低剂量治疗组MMP-9阳性表达细胞数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均＜0.05)(见图7、图8)。

2.3 TanⅡA对神经元凋亡的比较 见表2。假手术组可见到少量凋亡细胞。IR组凋亡细胞数阳性率增加，与假手术组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)(见图9)。与IR组比较，TanⅡA高、低剂量治疗组凋亡细胞数阳性率均明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA 组(P 均 ＜0.05)(见图10、图11)。

2.4 TanⅡA对EB含量的影响 IR组EB含量明显升高，与假手术组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05);与 IR 组比较，TanⅡA 高、低剂量治疗组EB含量明显降低(P＜0.05)，且高TanⅡA组明显低于低TanⅡA组(P均＜0.05)。

图1 Sham组可见少量磷酸化p38MAPK表达

图2 IR组可见大量的磷酸化p38MAPK表达

图3 TanⅡA低剂量组p38MAPK表达较IR组减少

图4 TanⅡA高剂量组p38MAPK表达较低剂量组减少

图5 Sham组可见少量MMP-9表达

图6 IR组MMP-9表达增加

图7 TanⅡA低剂量组MMP-9表达较IR组减少

图8 TanⅡA高剂量组MMP-9表达较低剂量组减少

图9 IR组可见较多凋亡阳性细胞表达

图10 TanⅡA低剂量治疗组凋亡阳性细胞较IR组减少

图11 TanⅡA高剂量治疗组凋亡阳性细胞较低剂量治疗组减少(图片均为SP染色，×400)

表1 TanⅡA对磷酸化p38MPAK和MMP-9表达的影响(±s)

表1 TanⅡA对磷酸化p38MPAK和MMP-9表达的影响(±s)

与 Sham组比较*P＜0.05;与 IR组比较 △P＜0.05;与TANⅡA低剂量治疗组比较▲P＜0.05

组别 n 磷酸化p38MAPK MMP-9 Sham组IR组TanⅡA低剂量组TanⅡA高剂量组5 5 5 5 20.60 ±2.19 99.00 ±11.13*67.27 ±4.13△30.80 ±2.70△▲92.20 ±3.27 144.40 ±14.94*105.13 ±2.32△85.93 ±1.79△▲

表2 TanⅡA对凋亡细胞数和EB含量的影响(±s)

表2 TanⅡA对凋亡细胞数和EB含量的影响(±s)

与 Sham 组比较*P＜0.05;与 IR组比较△P＜0.05;与TANⅡA低剂量治疗组比较▲P＜0.05

组别 n 凋亡细胞数阳性率 EB含量(μg/g)假手术组IR组TanⅡA低剂量组TanⅡA高剂量组5 5 5 5 3.48 ±1.15 40.31 ±4.35*34.42 ±3.86△20.15 ±2.38△▲56.18 ±2.11 92.17 ±3.55*81.27 ±3.14△72.55 ±1.59△▲

3 讨论

P38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)成员之一，参与调节细胞的增殖、分化和调控，是将细胞外刺激信号传导至细胞内，并调控其它基因表达的重要通路之一。近年有研究表明，脑缺血再灌注后P38MAPK显著升高，给予P38MAPK特异性抑制剂SB203580可以不同程度的减少梗死体积和神经元损害，提示P38MAPK通路参与了缺血后继发性脑损伤的信号传导［10，11］。MMP-9 是一组 Zn2+依赖的金属蛋白酶家族，目前认为与脑缺血后血脑屏障损伤的关系最为密切，抑制它的活化可在一定程度上减轻再灌注血脑屏障损伤［12］。

本实验研究显示，大鼠脑缺血再灌注24h，脑组织磷酸化的p38MAPK在缺血侧额顶部皮质的梗死区表达明显增多，并且该区域凋亡细胞明显增加，表明p38MAPK信号通路在脑缺血中参与了神经元凋亡过程，这与Sasaki等［13］的研究基本一致。大鼠脑缺血再灌注24h，缺血侧额顶部皮质MMP-9表达明显增加，并且缺血侧脑组织EB含量亦明显增加，表明脑缺血再灌注损伤后血脑血脑屏障破坏，与以往研究相符［14］。

TanⅡA为丹参酮中含量最高的活性成分，我们前期研究发现［3，4］，TanⅡA 能够显著减小脑梗死体积具有脑保护作用。本实验研究结果表明，给予不同剂量的TanⅡA治疗脑缺血再灌注损伤大鼠，可明显减少缺血侧磷酸化p38MAPK表达，减少细胞凋亡。有研究发现，p38MAPK通过调控c-fos或 c-Jun表达，改变凋亡晚期基因 caspase-3的表达介导凋亡［15］。因此，我们推测，TanⅡA抗凋亡作用与抑制再灌注损伤后p38MAPK通路而下调caspase-3的表达有关［3］。

本实验研究还发现，给予不同剂量的TanⅡA治疗脑缺血再灌注损伤大鼠，可明显减少缺血侧MMP-9的表达，减少缺血侧脑组织EB含量，表明TanⅡA具有减少再灌注损伤后血脑屏障破坏的作用。近期研究表明，p38MAPK的表达与MMP-9存在相关性［16］。p38MAPK通过影响一氧化氮合酶(NOS)的表达而调节一氧化氮(NO)含量［17］，而NO可以通过鸟苷酸环化酶以及cGMP水平对MMP-9 活 性 起 到 重 要 调 节 作 用［18，19］，提 示p38MAPK、NO和MMP-9三者间可能存在序贯的激活关系。我们前期研究发现［20］，TanⅡA能明显抑制NO及NOS的表达。因此我们推测，TanⅡA通过抑制p38MAPK通路，减少NOS的表达和NO的生成，从而下调MMP-9的表达，这可能是其减少血脑屏障破坏的机制之一。

［1］Strassburger M，Braun H，Reymann KG.Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective，decreases the number of activatedmicroglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures［J］.Eur JPharmacol，2008，592(1-3):55-61.

［2］阎 伟，孙 微，张翠荣，等.脑缺血/再灌注损伤时MMP-9的表达及银杏叶提取物的干预作用［J］.中风与神经疾病杂志，2007，24(1):83-85.

［3］李 浩，刘开祥，俸军林，等.丹参酮ⅡA对鼠脑缺血再灌注损伤Bcl-2和Caspase-3表达的影响［J］.中国康复医学杂志，2008，23(8):691-693.

［4］李 浩，刘开祥，俸军林，等.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制［J］.时珍国医国药，2008，19(7):1648-1649.

［5］李 浩，刘开祥，俸军林，等.丹参酮ⅡA对鼠脑缺血再灌注损伤凋亡基因表达的影响［J］.时珍国医国药，2009，20(1):82-84.

［6］李 浩，刘开祥，俸军林，等.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠P-选择素和细胞间黏附分子-1表达的影响［J］.中国医师杂志，2008，10(4):444-447.

［7］李 浩，刘开祥，俸军林，等.丹参酮ⅡA对大鼠脑缺血-再灌注损伤细胞间黏附分子-1表达及髓过氧化物酶活性的影响［J］.中国现代神经疾病杂志，2008，8(4):349-352.

［8］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversiblemiddle cerebral artery occusion wit hout cranietomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［9］Matsuo Y，M ihara S I，Ninom iya M，etal.P ro tective effect of endothelin type A receptor antagonist on brain edema and injury after transientm iddle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，2001，32(9):2143-2148.

［10］Zheng GY，Chen XC，Du J，etal.Inhibitory action of propyl gallate on the activation of SAPK/JNK and p38MAPK induced by cerebral ischemia-reperfusion in rats［J］.Yao Xue Xue Bao，2006，41(6):548-554.

［11］Lu Q，Rau TF，Harris V，etal.ncreased p38 mitogen-activated protein kinase signaling is involved in the oxidative stress associated with oxygen and glucose deprivation in neonatal hippocampal slice cultures［J］.Eur JNeurosci，2011，34(7):1093-1101.

［12］Yang Y，Estrada EY，Thompson JF，etal.Matrixmetalloproteinasemediated disruption of tight junction proteins in cerebral vessels is reversed by synthetic matrix metalloproteinase inhibitor in focal ischemia in rats［J］.JCerebral Blood Flow Metab，2007，27(4):697-709.

［13］Sasaki K，Chiba K.Induction of apoptosis in starfish eggs requires spontaneous inactivation of MAPK(extracellular signal2regulated kinase)followed by activation of p38αMAPK［J］.Mol Biol Cell，2004，15(3):1387-1396.

［14］Li Q，Zhang R，Ge YL，etal.Effects of neuregulin on expression of MMP-9 and NSE in brain of ischemia/reperfusion rat［J］.JMol Neurosci，2009，38(2):207-215.

［15］李广明，李 军，曹 红，等.SB202190减轻沙鼠海马CA1区脑缺血再灌注的作用及磷酸化Caspase-3含量变化关系［J］.中国药理学通报，2005，21(9):1150-1151.

［16］Ralay Ranaivo H，Hodge JN，ChoiN，etal.Albumin induces upregulation ofmatrixmetalloproteinase-9 in astrocytes via MAPK and reactive oxygen species-dependent pathways［J］.J Neuroinflammation，2012，9(1):68.

［17］Ratajczak-WronaW，Jablonska E，Marcinczyk M，etal.Role of p38 MAPK pathway in induction of iNOS expression in neutrophils and peripheral blood mononuclear cells in patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity［J］.JOral Maxillofacial Suer，2009，67:2354-2363.

［18］Shin CY，Lee WJ，Choi JW，etal.Down-regulation ofmatrixmetalloproteinase-9 expression by nitric oxide in lipopolysaccharide-stimulated rat primary astrocytes［J］.Nitric Oxide，2007，16(4):425-432.

［19］Ridnour LA，Windhausen AN，Isenberg JS，etal.Nitric oxide regulatesmatrix metalloproteinase-9 activity by guanylylcyclase-dependent and-independent pathways［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:16898-16903.

［20］李 浩，刘开祥，俸军林.丹参酮ⅡA对鼠脑缺血再灌注损伤一氧化氮及一氧化氮合酶的影响［J］.中国康复理论与实践，2008，14(5):430-432.